巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展pdf.doc

江苏农业科学2012年第40卷第3期 一35一 晶，吴正钧，任 婧．巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展[J]．江苏农业科学，2012，40(3)：35—38 巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展 姚晶1’。，吴正钧2，任婧1 (1．乳业生物技术国家重点实验室／光明乳业股份有限公司技术中心，上海200436；2．上海海洋大学食品学院，上海201306) 摘要：巴氏毕赤酵母表达系统具有优良的特性，是目前广泛应用的微生物表达系统之一，它在理论研究和实践应 用上尤其是在大规模发酵中具有重要的意义。本研究综述了巴氏毕赤酵母的生物学和遗传学特性，详细阐述了巴氏 毕赤酵母表达系统的组成以及影响外源基因表达的因素，并提出了一些提高表达量的方法。 关键词：巴氏毕赤酵母；表达系统；表达；影响因素 中图分类号：Q786 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2012)03—0035—04  随着分子生物学理论研究的不断深入，分子生物学技术 得到了快速发展，与此同时，构建的不同表达系统也层出不 穷。巴氏毕赤酵母(Pwhiapastor括)是1969年由Ogata等首次 发现的，并于20世纪80年代迅速发展为一个新兴的表达系 统 。巴氏毕赤酵母表达系统具有优势的生物学和遗传学 特性，和大肠埃希菌(E scherwhm coli)、酿酒酵母(Saccharo— m，，凹s cerev西iae)等传统表达系统一样，被广泛用于外源基因 的表达。 1巴氏毕赤酵母的特性 巴氏毕赤酵母是一种甲基营养型酵母。甲基营养型酵母 是指一类可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基上生长的 酵母菌，主要包括：汉逊酵母属(Hansenula)、念珠酵母属 (Candida)、球拟酵母属(％删掣蠡)、克勒克酵母属(K如eck— em)以及毕赤酵母属(Pwhia)等。现研究证实，可作为表达 外源蛋白的宿主菌的主要是巴氏毕赤酵母(P．pastoris)和多 形汉逊酵母(H polymorpha)旧o。甲基营养型酵母的甲醇代 谢途径与甲醇氧化机制非常相似，图1为甲醇在巴氏毕赤酵 母中的代谢过程睁1，甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能 源的培养基中生长，因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需 酶，如醇氧化酶(AOX)、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其 中AOX是甲醇酵母代谢途径中的第1个酶，它催化甲醇被氧 化为甲醛和过氧化氢，过氧化氢进一步由过氧化氢酶分解成 水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶(FMD)和甲酸脱氢酶 (FMDH)氧化成CO：，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5P)、二羟丙 酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羟 丙酮(DHAP)；DHAP与GAP在1，6一二磷酸果糖醛缩酶作 用下形成果糖一1，6一二磷酸(FBP)；FBP又经1，5一二 磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5P和GAP；Xu5P又一次参加循 收稿日期：2011—05一09 基金项目：国家“973”计划(编号：2010cB735705)；上海市科委课题 (编号：09DZ2251400)。 作者简介：姚晶(1987一)，男，江苏宜兴人，硕士研究生，主要从事食 品生物技术研究。E—mail：yawin905@sina．com。 通信作者：任 婧，博士，主要从事乳酸菌分子生物学研究。E— mail：叫ing@bnghtdairy．corn。  1一醇氧酶；2一过氧化氢酶；3一甲醛脱氢酶；4一甲 酸脱氢酶；5～二羟丙酮合成酶；6-二羟丙酮激酶； 7—1，6一二磷酸果糖醛缩酶；8一果糖一l，6．二磷酸化酶； 9一甲醛还原酶 图1 巴氏毕赤酵母中甲醇的代谢途径 环，而GAP有1／3进入主代谢途径，用于合成其他物质。 从图1中可以看出，在甲醇代谢途径中，涉及到多种酶， 这些酶都是由染色体上的有关基因编码表达的。巴氏毕赤酵 母染色体内含有甲醇代谢必需的关键调控酶——醇氧酶(al- eohol oxidase，AOX)基因，它可以产生2种酶——A0x 1和 AOX 2。当葡萄糖、甘油或乙醇等作为碳源时，AOX几乎不表 达，进一步研究表明AOX的表达受转录水平调控，强诱导型 启动子Paox能有效控制AOX表达H1。最近有研究报道，将 顺式元件与原始启动子连接成新型的人工启动子，可以提高 外源蛋白的产量和活性”1。此外，甲醇代谢所需的醇氧化酶 被分选到过氧化物酶(pero】【isome)体中，形成区域化：在以葡 萄糖作碳源时，菌体中只有1个或几个很小的过氧化物酶体； 而在以甲醇作碳源时，过氧化物酶体几乎占到整个细胞体积 的80％，因此，当在AOX基因前利用同源重组方式插入外源 蛋白基因时，可获得大量表达怕1。在构建表达菌株时，AOX 的1个或2个基因的缺失就会导致菌株对甲醇利用能力的改 变，根据菌株的基因型可将毕赤酵母分成3种