应用质粒作为基因克隆的载体分子.PPT

第四章 基因工程的质粒载体 载体通论 （一）基本概念 载体：在基因工程中，用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。 （二）分类 克隆载体 表达载体 质粒载体 噬菌体载体 人工染色体 在基因克隆时：将目的片段转移到宿主细胞中进行复制克隆——克隆载体； 在基因导入受体时：将目的片段转移到受体细胞中并进行使之表达——转化载体或表达载体。 常用基因工程载体有： 细菌质粒(克隆)； λ噬菌体(克隆)； 柯斯质粒(克隆)； 穿梭质粒(克隆/表达)； 细菌人工染色体(克隆/表达)； 酵母人工染色体(克隆/表达)； Ti质粒及其衍生载体(转化)。 （三）基因工程载体必须具备的条件： ※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目 （5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件 v）四环素（Tetracycline，Tet） b）细菌抗性原理 a）抑菌原理 通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。 Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。 ② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。 （2）抗菌素选择原理 活 死 抗性基因 抗菌素 4. 人工构建的质粒载体的类型 （1）高拷贝数的质粒载体 ColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。 而且在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数1000—3000个！ 适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的基因产物。 （2）低拷贝数的质粒载体 但有特殊用途: 由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。 当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。 pLG338、pLG339、pHSG415等 不适合大量扩增DNA用。 适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。 （3）失控的质粒载体（runaway plasmid vectors） 这是一类温度敏感型复制控制质粒。 温度低（低于37 oC），拷贝数很少； 温度增加（40 oC）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。 1979年B. E. Uhlin等构建。如pBEU1、pBEU2。 在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。 （4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。 如pDF41、pDF42、pBR329。 抗菌素抗性 外源DNA 无抗菌素抗性 选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。 （5）正选择的质粒载体(Direct selection vectors) 如pUR2、pTR262等。 只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。 具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。 目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。 （6） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。 注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。 使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。 它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。　 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS 2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。 1）普通载体元件 ① 表达载体的结构 五、重要的