福建省农科院生物技术中心农业环保技术研究室 - yzxzcom.PDF

编号：农环组菌字[2002-07-28], 共 4 页 试验项目：青枯菌不同菌株质粒的抽提（一） 试验人员：葛慈斌 曹宜 试验负责：葛慈斌 曹宜 报告日期：2002 年 7 月 28 日 福建省农科院生物技术中心 农业环保技术研究室 电话: 7835334, 传真: 7809378 第 ２ 页 共 4 页 试验报告 ２ 1．试验目的 质粒是一些双链、闭环的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅 助性遗传单位，其大小范围从1kb至200kb以上不等，已经在形性色色的细菌类群中发 现有质粒的存在。本试验通过抽提青枯菌不同致病力菌株的质粒、经琼脂糖凝胶电泳检 测，来分析这些不同致病力的菌株在质粒的有无、大小等方面是否具有差异。 2 ．试验方法 （1）青枯菌不同致病力菌株的培养与收获： a、从保存在无菌水中的不同青枯菌菌种中，选出经 TTC 培养基和电镜扫描鉴别为强 菌株6株、弱菌株7株，在TTC平板上划线接种，培养。 b、48h后，分别从TTC平板上挑取单菌落，悬浮在SPA液体培养基内，上摇床振荡培 养。48h 后，停止发酵，取 3ml 发酵液倒入 7ml 离心管中，用冷冻高速离心机于 4℃以 12000g离心10min，吸去上清液，使青枯菌沉淀尽可能干燥。 c、将剩余的青枯菌发酵液保存于4℃冰箱。 （2）碱裂解法抽提质粒： a、将青枯菌沉淀（上述步骤b所得）重悬于200ul用冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈振荡。 溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖、 25mmol/L Tris•Cl(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) b、加 400ul 新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内容物。不 要振荡，将离心管放置于冰上。 溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH 1%SDS c、加 300ul 用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡 10sec 使溶液Ⅲ 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5min。 溶液Ⅲ：5mol/L 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 水 28.5ml d、用冷冻高速离心机于4℃以12000g离心10min，将上清液（500ul）转移到微量离 第 ３ 页 共 4 页 试验报告 ３ 心管（1.5ml）中。 e、用2倍体积的乙醇于室温沉淀双链DNA。振荡混合，于室温放置2min。 f、用冷冻高速离心机于4℃以12000g离心10min。 g、小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管 壁的液滴除尽。 h、用 1ml70%乙醇于 4℃洗涤双链 DNA 沉淀，按步骤 g 所述方法去掉上清，在空气中 使核酸沉淀干燥10min。 i、用40ul无菌水重新溶解核酸，取少量溶液用于琼脂糖凝胶电泳分析。电泳分析时， 琼脂糖凝胶浓度为1.0%，电压30v，电泳时间100min。 3 ．试验结果 电泳结束后，将凝胶放置在自动成像仪上，扫描结果。电泳结果如下图所示： 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 图 1、不同青枯菌菌株质粒的琼脂糖凝胶电泳图谱 （注：图中 1 为Marker，2-6和 12为强致病力菌株，7-11和 13、14 为弱致病力菌株。 最上方箭头指示的为点样孔、中间箭头指示质粒带、下方箭头指示 RNA。）