紫外线对枯草芽孢杆菌诱变素材.pptVIP

紫外线诱导枯草芽孢杆 菌突变 第六组小组成员 实验目的： 学习微生物诱变育种的基本操作方法 实验内容： 1：对枯草芽孢杆菌出发菌株进行处理 制备菌悬液。 2：对紫外线进行诱变处理。 实验材料和用具1 菌种:枯草芽孢杆菌2 培养基:淀粉培养基。3 主要药品:牛肉膏、蛋白胨、Nacl、可溶性淀粉、碘液，生理盐水。4主要器皿:试管、移液管、锥形瓶、量筒、烧杯、紫外灯、离心机、培养皿等。 技术路线： 材料器具准备 菌悬液制备 平板制作 紫外线诱变处理 稀释菌悬液 稀释涂平板 计算存活率 及致死率 操作步骤1.菌悬液制备 将枯草芽孢杆菌接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，37℃培养20h，使其活化，取已培养20 h 的活化枯草芽孢杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，倒入离心管中，离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞浓度为108/mL。2. 平板制作将培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。 3诱变处理用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验用紫外线照射的诱变方法。(1)．紫外线处理 打开紫外灯预热20min。取5mL 菌悬液放在无菌的培养皿中，同时制作5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处，照射l min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始进行搅拌，即时计算时间，照射时间分别为15 s、30 s、l min、2 min、5 min。照射后，诱变菌液在黑暗中保存1～2h 然后稀释涂菌进行初筛。(2)．稀释菌悬液 按10 倍稀释至10-6，从10-5?和10-6?中各取出0.lmL 加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3 个重复)，然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2～3d。 4稀释涂平板  取未照射的菌悬液(作为对照)和照射过的菌悬液各0.5 mL 进行不同程度的稀释。取最后3 个稀释度的稀释液涂于淀粉培养基平板上，每个平板加稀释液0.1 mL，用无菌玻璃刮棒涂匀，培养48 h(用报纸包好平板)。注意在每个平板背后要标明处理时间、稀释度。 注：枯草芽孢杆菌诱变前：稀释至10-8，10-7,10-6，生理盐水 枯草芽孢杆菌照射1min稀释至10-8,10-7,10-6，生理盐水 枯草芽孢杆菌照射2min稀释至10-8,10-7，10-6，生理盐水 枯草芽孢杆菌照射3min稀释至10-8，10 存活率将培养48 h 后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出对照样品1 mL 菌液中的活菌数。 同样计算用紫外线处理1、2、3min 后的存活细胞数及致死率。 注 意 事 项 1：紫外线照射时注意保 护眼睛和皮肤。 2：诱变过程及诱变后 的稀释操作在无菌下进行并黑暗中培养。 实验结果分析 实验结论： 实验失败 失败原因分析：细节决定成败 1：制作牛肉膏蛋白胨培养基时，没有调到合适的 PH。 2：培养基灭菌处理没有处理好，导致杂菌没有 灭干净。 3：接种过程中由于在酒精灯上灼烧时间长且 没有完全冷却就进行接种导致菌种被烫死。 培养基培养时没有长出实验中所需菌落。 失败原因 4：紫外线诱变过程及诱变后的稀释操作没有在无菌下进行， 在黑暗中培养时间过短。 5：涂平板时离酒精灯远进，导致杂菌进入，最后 菌落没有长出，且其他杂菌生长旺盛。 6：由于以上所有操作都应无菌操作进行，但实际操作没有 做到无菌操作，最后导致平板上菌落较杂，分不清枯草芽 孢杆菌菌落无法计数。 教训 1：实验操作提前准备 材料及器材。 2：无菌操作时严格 按照无菌操作 技术操作。 3：紫外线诱变处 理时注意黑暗 培养。 4：遇到不会的要 及时询问，不能 自己随便做。 参考文献： [1]李豪，车振明.微波诱变微生物育种的研究[J].山西食品工业，2005,6（2）. 简要概括了国内外微波诱变育种领域的研究新进展，对微波的生物学效应及诱变微生物的机 理进行了总结和讨论，在此基础上探讨了微波诱变微生物育种的应用性研究。最后，对本领域的发展进行了展望。 [2]孙金旭.乳酒酵母紫外诱变原生质体制备研究[J].酿酒科技，2008（6）. 在乳酒酵母原生质体形成率和再生率影响单因素研究的基础上，对菌龄、酵解温度、酵解时间、酶浓度、稳渗剂采用L16（4）5正交试验，评价各因素的影响程度，得出适宜该菌原生质体制备的条件。 [3]周德明，冯友仁，梁帅.木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶高产菌株的诱变育种[J].中国林业科技大学学报，2009,10（5）. 利用低能N