第五章 克隆基因的表达.ppt

化学诱导型表达调控系统的原理 一般来说，化学诱导调控系统都包含两个转录单元。第一个转录单元由一个组成型启动子（通常为35S启动子）驱动一个对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合位点、微型植物启动子（通常为截短的35S启动子）和目的基因串联而成。 农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化 1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒（大于200kb），称为Ti质粒。 1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时，用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段，称为T-DNA（Transfer-DNA）。实验表明，T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达，从而导致了冠瘿瘤的发生。进一步研究发现，整合到植物基因组中的T-DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代，Ti质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础。 第五章 克隆基因的表达 第一节 基因表达的基本条件 第二节 原核表达载体的构建 第三节 克隆基因在植物细胞中的表达 第三节 克隆基因在植物细胞中的表达 一、真核基因表达的特点 二、用于植物表达的启动子类型 三、 Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化 真核基因表达的特点 一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式； 基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合； mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程； 基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。 真核基因转录起始位点上游序列的特点 特点 起始位点 上游调控区 其它调控区 原核生物 嘌呤和嘧啶都能起始转录 范围小，-10区，-30到-70区为正调控区，+10到-20区为负调控区； 有TTGACA区(-30~ -40）参与调控。 真核生物 有“帽子”结构专一性（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（A为主）才能起始转录 范围大，TATAA/TA区位于-20到-30，-40到-110区为上游激活区； 除了有对应的CAAT区外，还有GC区和增强子。 基因转录起始位点上游序列的比较 TTGACA TATAAT Pu Py -35区 -30 -70 正调控区 -20 负调控区 +1 -10区 GC区….CAAT区 TATAAA T PuAPy -40 -110 +1 -20 -30 增强子 CCGCCC或GGGCGG或GGCCAATCT T A 原核 真核 第三节 克隆基因在植物细胞中的表达 一、真核基因表达的特点 二、用于植物表达的启动子类型 三、 Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化 驱动转基因表达的启动子类型 天然诱导 型启动子 组织特异性表达 诱导型表达 化学诱导型 调控体系 组织特异 型启动子 组成型表达 花椰采花叶病毒(CaMV) 35S启动子 水稻肌动蛋白1 (actin 1) act1启动子 Datta （1998） rice 玉米pGL2 髓部 Varvara （2001） 番茄 发根农杆菌的rolD启动子 根系 Russell （1997） maize 玉米淀粉合酶基因GBS 胚乳 Martineau （1995） tomato ovary tissue （patent） 果实 Shi （1994） tobacco 水稻蔗糖合酶基因RSs1 韧皮部 Kozial （1993） maize PEPC （Pepcarboxylase Gene of Maize） 叶片 Altabella （1990） tobacco 菜豆植物凝集素基因PHA-L 种子 Mariani （1990） 烟草 油菜 烟草Ta29 花药 作者 目的植物 启动子来源 表达组织 部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子 RSuS1启动子的组织特异性表达 35S-Gus RSP1/2-Gus 化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启动或表达关闭的转基因调控系统。和植物天然的诱导型启动子相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。 作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一，化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中其本身含量低且对受体作物无毒害作