碱性磷酸酶的分离提取案例.ppt

Page ? * 碱性磷酸酶的提取鉴定 朱** 金** 王** 何* 碱性磷酸酶 广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。 * 如何获取碱性磷酸酶 碱性磷酸酶（AKP）溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。 *   1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。 2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及鉴定的方法 实验目的 *   实验原理 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二 钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶 液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾 氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与 AKP活性成正比。 * 碱性磷酸酶的提取 称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行匀浆。将其转入离心管，并加2ml 0.01 mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。 * 碱性磷酸酶的提取 在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌 2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心管。 * 碱性磷酸酶的纯化 滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min 5min。弃上清，沉淀用4ml 0.5mol/L Mg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。 在悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上清液于另一离心管。 上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，沉淀用4ml 0.01M Mg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。 * 碱性磷酸酶的纯化 其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min 离心5min，取上清液丢弃沉淀。 上清液中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。 沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作为D液用于比活性测定。 * * 碱性磷酸酶活性的鉴定 磷酸苯二钠 磷酸盐 + 酚 酚 + 4-氨基安替比林 红色醌类衍生物 AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解 磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为激活剂。 AKP 铁氰化钾 * * 管号 空白 标准 A B C D 酶液体 0.1 0.1 0.1 0.1 酚标准液 0.1 Tris-Mg(AC)2 0.1 复合底物 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 * 加入底物后, 立即混匀, 37 ℃ 准确15 min后加入0.5%铁氰化钾2.0 ml终止反应, 混匀, 静置15 min , 510 nm比色 * 酶活性单位（U/ml)= A样 A标 *0.1*稀释倍数 * Page ? *