第十章 基因工程的应用概要1.ppt

第十章 基因工程的应用 二、定点突变（site-specific mutagenesis） 1. M13 DNA进行的寡核苷酸介导诱变 （3）缺点： 2. 寡核苷酸介导的PCR诱变 3.改进型双引物诱变 4. 重叠延伸诱变 第二节 基因工程生产抗体 一、抗体（antibody） 二、抗体的结构和功能 （2）抗体各部位的功能 抗体分子的空间结构 （3）木瓜蛋白酶处理后的抗体的结构 （4）Fab和Fc片段的功能 三、抗体的表达系统 （3）表达载体 Filamentous phage fd （3）方法 第三节 基因工程生产疫苗 3. 疫苗的发展 4. 疫苗的成分 二、基因工程疫苗 （1）亚基疫苗的优缺点： （2）亚基疫苗举例 ②口蹄疫病毒（FMDV）疫苗 2.肽疫苗 3.活体重组疫苗 霍乱活体重组疫苗的制作 4.细菌疫苗 5.肿瘤疫苗 6.DNA疫苗 （1）DNA疫苗的构成 ii）抗原编码基因的分离和筛选 ② 质粒表达载体 （2）DNA疫苗的作用机理 （5）DNA疫苗的改进 第四节 人类疾病的基因治疗 一、基因治疗的回顾和现状 第一位接受基因治疗的人 二、体细胞治疗的生物学问题 三、基因治疗的方案 3. 反义（antisense）基因治疗。 反义RNA的作用 4. 核酶（ribozyme）基因治疗。 四、基因治疗用的载体 反转录病毒结构 流感病毒 HIV 如Moloney murine leukemia virus(Moloney MLV) （1）反转录病毒载体的优点 （2）用于基因治疗的反转录病毒载体构建 （3）包装细胞系的构建 包装细胞 （4）载体RNA的包装 2.腺病毒（adenovirus）载体 腺病毒的结构 （3）腺病毒载体的构建 （4）重组腺病毒DNA在细胞中的生存 五、癌症的基因治疗 （2）导入抑癌基因的基因治疗 （3）针对癌基因的基因治疗 旁观者效应（bystander effect）： （5）导入细胞因子基因进行基因治疗 （6）导入MHC I类抗原基因进行基因治疗 尾声：基因工程技术的社会伦理问题 四、基因工程的伦理问题 五、基因技术的社会问题 国际上已批准的130多种基因治疗方案中，70%是针对癌症的。 （1）癌症的基因治疗中常用的治疗性基因 ①直接杀伤或抑制癌细胞生长的基因： 抑癌基因、癌基因的反义序列、编码细胞程序性死亡的基因等。 ②可提高免疫系统能力的基因： 细胞因子基因等。 ③多种药物的耐药性基因： 主要目的是提高造血细胞及其他细胞对放疗、化疗及其他抗癌药物的耐受性。 癌症一般是一对抑癌基因都发生了失活突变。因此导入一个抑癌基因能抑制癌细胞的生长甚至使肿瘤细胞逆转。 如抑癌基因：Rb、P16、P21、P53、Dcc等。 用反义疗法导入癌基因的反义DNA或RNA，使癌基因产物减少。 如k-ras的反义基因。 （4）用“自杀基因”（suicide gene） 将一种基因转入癌细胞，这种基因编码的蛋白能把无害的药物前体（prodrug）转变为有毒物质，从而将癌细胞杀死。 如胸苷激酶基因（tk） ①原理： 基因治疗中使用的tk是底物特异性较差的HSV-1-tk（单纯疱疹I型）和VZV-tk（水痘带状疱疹）。 Tk的正常功能： 胸苷 dTMP HSV-1-tk还能催化： 无环鸟苷（ACV） 9-鸟嘌呤（GCV） 磷酸化产物 掺入DNA DNA链不能延伸 细胞死亡 VZV-tk能特异性催化6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖核苷（araM）的磷酸化，形成araMP。araMP在细胞中进一步被其他的酶转化成araATP。 araM araMP VZV-tk araATP araATP是DNA聚合酶的抑制物。 只要有部分肿瘤细胞导入tk，就可杀死全部的肿瘤细胞。（机理不清） 提高机体的免疫力。对原发肿瘤细胞和转移肿瘤细胞作出免疫应答。 如：IL-2、IL-4、IL-6、IL7、TWF、INF-?、GM-CSF 其中使用最广泛的是IL-2与LAK细胞联合使用治疗黑色素瘤和肾癌。 多选用反转录病毒。（只转染处在分裂状态的细胞）。 ②载体： 肿瘤细胞一般不表达MHC I类抗原，从而逃避免疫系统对他的识别。 导入MHC I类抗原基因，提高免疫系统对肿瘤细胞的识别，杀伤肿瘤细胞。 （7）导入MDR1基因进行基因治疗 MDR1编码一种称为P-糖蛋白的穿膜蛋白，它可以将对正常细胞有毒的药物泵出细胞外，保护正常细胞免受药物杀伤。 如导入骨髓前体细胞或造血干细胞。 迄今为止，还没有遗传病患者经传统的治疗方法治疗后能过上正常人的生活，他们的后代也同样难逃厄运。 临床统计： 25%的生理缺陷、30%的儿童死亡、60%的成年人疾病都是由遗传疾病引起的。 （1）基因治疗的概念 向靶组织或细胞中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺