DB21∕T 2252-2014 Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR检测方法.pdfVIP

ICS 11.220 B 41 DB21 宁 省 地 方 标 准 DB 21/ T 2252 2014 Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR 检测方法 Method of RT-PCR for the detection of type O foot and mouth disease virus 2014 - 03 - 07 发布 2014 - 05 - 07 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 2252 2014 Ｏ型口蹄疫病毒RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了Ｏ型口蹄疫病毒（FMDV-O）RT-PCR检测方法的实验材料、仪器设备、试剂、操作步 骤和结果判定，并介绍了其原理。 本标准适用于动物及动物产品中Ｏ型口蹄疫病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于 文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版 适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 文件。 GB/T 6682-1992 分析实验室用水规格和试验方法 中华人民共和国农业部 告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于 标准。 DEPC 焦炭酸二乙酯 RNA 核糖核酸 RT-PCR 反转录聚合酶链反应 dNTP 脱氧核苷酸三磷酸 bp 碱基对 Ｏ-P液 牛、羊食道-咽部分泌物 4 原理 FMDV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据FMDV-O保守基 因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以引物为延伸起点，通过变性、 退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA 。 5 实验材料、仪器设备和试剂 5.1 实验材料 眼科剪、眼科镊、称量纸、1.5mL灭菌离心管 （ DEPC水处理）、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL 量筒、500mL三角瓶、吸头 （10µL、200µL、1000µL）。 5.2 仪器设备 1 DB21/T 2252 2014 分析天平、低温高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、 －70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、－20℃冰箱、可调移液器（最大量程分别为2µL、20µL、200µL、1000µL）。 5.3 试剂 5.3.1 2.5 mmol/L dNTP。 5.3.2 引物：上游引物5′-AGATTTGTGAAAGTAACACCA-3′，下游引物5′-CATGTCCTCTTGCATCTGGTT-3 ′。 5.3.3 10 倍PCR 缓冲液。 5.3.4 1%溴化乙锭 （EB）溶液 （见第A.1）。 5.3.5 电泳缓冲液 （50 倍）（见第A.2）。 5.3.6 1%琼脂糖凝胶 （见第A.3）。 5.3.7 75%乙醇 （见第A.4）。 5.3.8 灭菌DEPC 水（见第A.5）。 5.3.9 上样缓冲液(见第A.6)。 5.3.10 电泳缓冲液 （1倍）（见第A .7）。 5.3.11 磷酸盐缓冲液 （0.04mol/L