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犬腺病毒基因疫苗及实验免疫研究 邱薇1范泉水1李作生1郑颖1杨美峰1尹惠琼1王双印1夏咸柱2 1成都军区联勤部军事医学研究所2军事医学科学院军事兽医研究所 犬腺病毒(anineadmovin坞cA_v)是已发现的哺乳动物腙病毒属中致病性最强、形态结 构也研究得较为清楚的一种动物病毒it]，其1型(CAV一1)腺病毒是引起犬传染性肝炎和 熊、狐脑炎的病原【2．3．4’；犬2型腺病毒(CAV一2)主要感染幼犬导致传染性喉气管炎和肠炎 [5]，刮。CAV的纤突蛋白与其毒力、亲嗜性、抗原性、血凝性以及免疫原性有关，纤突蛋白 在病毒吸附到细胞表面受体的感染过程中起着决定性作用[7]。核酸疫苗(nucleieaeidvae— cines，NAv8)通过宿主细胞的转录系统，使外源基冈在活体内表达，产生的抗原激活机体的 免疫系统，诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答，从而达到预防利治疗疾病的目的。 NAV不仅保持病毒抗原的天然形式¨J，还提高了毒株问的交叉保护髂力，可诱导体液和细 胞免疫，不复制，不感染宿主，我们选择了纤突基因来构建真核重组表达载体(peChV—F)， 该戴体可诱导犬产生较高的免疫反应，使大部分犬能够抵抗强毒的攻击，现报告如下。 1材料与方法 1．1试剂、细胞株及动物限制性核酸内切酶BamHI、HindⅢ及T4DNA连接酶购臼人迕 宝生物公司。pcDNA3载体由本实验室保存。DNA胶回收试荆盒购自上海华舜生物工程有 限公司。大肠杆菌JMl09感受态细胞由本实验室制备。犬肾细胞(DK)、CAV毒株由本实验 室保存。5只混合饲养的CAVSN效价≤2的昆明犬为市售。 1．2引物根据犬腺病毒纤突基因设计并合成了一对引物，引物由上海生工合成。引物 序列如下：P15，一TrGGTACTrCCACTI渊G一3，：P25，一TAA帆CTCAAGGCGGC一 3，。 1．3CAr一2病毒DNA的制备【4]DK细胞按常规消化传代后37。C静置培养，待细胞K满 单层斤按培养液量的1／10接人CAV一2种毒，37℃静置培养至80％的细胞出现病变时齐上 5M 中，37C作用5min，其间轻轻倒转离心管20次，再加入0．5mlNaCl，混匀，37。C作用5min 清，将酚相及界面再用TE抽提两次以除去余留的DNA利RNA片段，然后在酚相及界面中 加入1．5倍体积的乙醇，冰浴10rain，5000rpm离心lOmin，将沉淀剐乙醇和乙醚各洗一次后 悬浮于0．5nd的TE(100mM NaCl和0．5％SDS)中，再加25019蛋白酶K，37℃作用至沉淀消 失。然后用等体积1E饱和酚抽提两次，将水相用等体积止J!醇抽捉一次，加入筇体积异 36mlTE中，加40Ul3M乙酸盐和2．5倍体积的乙醇重沉淀，70％乙醇洗一次，干燥，溶了适 量TE中。了一20C冻存。 188 1．4目的基因的PCR扩增与圄收以CAVDNA作为模板，用纤突基因引物进行PCR扩 5ul，10XBuffeT 5ul，无菌去离子水42ul。模板于95：13变性5分钟，PCR扩增循环如下：95t0 60s，60。C90s，72℃120s，循环35次，产物在0．8％琼脂糖凝胶上进行电泳，并用胶回收试剂 盒间收1．8协的目的片段。 1．5纤突基因的克隆和序列测定将回收的目的片段与T载体用T《DNA连接酶厂16C 连接过夜。转化JM]09感受态细胞，涂布含50W／-a氨苄青霉素的L8平板。37C培养过夜，挑 取单个菌落培养后抽提质粒并进行酶切鉴定，挑造反向插入的阳性重组质粒命名pTCAV— Fo川Ba枷和HindⅢ双酶切pTc认v—F，回收1．8kb的目的片段，再与同样双酶切和胶回 收纯化后的表达载体pcDNA3川IT，DNA连接酶于16C连接过夜，转化J》JMl09感受态细 胞，涂布含50ugeml氨苄青霉索的璩平板．37E培养过夜，挑取单个菌落培养后抽提质粒并 进行酶留鉴定．阳性重组质粒命名pccAv—F重组质牲由上海华舜生物工程有限公司进行 核苷酸序列测定，并与G∞Bnk中的纤尖序列进十肌匕牧。 处肌注。每隔8周在同样部位接种同样剂量的DNA，共接种3次，每次接种前采血样检测 效价。 I．7抗体分析以纯化的CAVIgG为阳性对照，用ELISA测定抗CAV‘抗体滴度，推测山 待检清的 1．8攻毒用CAY强毒(齐J量为1X]O’．TOl‰／JT)在第