Western_blot_试剂配制及实验步骤.pdfVIP

Western 印迹法 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列 的特异性试剂作为探针检测之。Western 使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋 白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混 合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20 ℃低温冰箱、垂直板电泳转 移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4 ％浓缩校、G250 考马斯亮 蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X （5X ）SDS 上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲 液、10X 丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、 抗体、化学发光试剂。 杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器 材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20 ×20cm ），X-光片夹，X-光片， 玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制： （一）母液 1.0mol/L Tris ·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH 至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌 后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml 离心管中，－20 ℃保存。 0.2mol/L NaH PO 2 4 NaH PO （MW119.98 ） 12g 2 4 蒸馏水至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 0.2mol/LNa HPO 2 4 Na HPO ·12H2O （MW 358.14 ） 71.6g 2 4 蒸馏水至 1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4 ℃保存，保存时间为1 周。 1.5mol/L Tris ·HC l （pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH 至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L Tris ·HCl （pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH 至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 40％Acr/Bic （37.5：1）