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米曲霉产脂肪酶发酵条件优化[摘要]对米曲霉产脂肪酶的发酵培养基进行优化。首先通过单因素试验确定发酵最适碳源为玉米粉,最适氮源为蛋白胨,然后通过Plackett-Burman优化选出对发酵影响最显著的因素,分别为蛋白胨、橄榄油、Na2HPO4。产脂肪酶的最适培养条件为:玉米粉0.5%,蛋白胨5%,橄榄油1.5%,NaNO3 1%,Na2HPO4 0.25%,KCl 0.05%,MgSO4 0.05%,FeSO4 0.001% [关键词]米曲霉脂肪酶发酵条件 脂肪酶广泛应用于脂肪的生产工艺、去污剂和脱脂业、食品、工艺、精细化学品合成业、造纸业、化妆品制造业以及制药业中,脂肪酶还可用于油脂垃圾和聚氨酯的快速降解,大多数工业生产的微生物脂肪酶是出自真菌和细菌的酶[1]。随着对脂肪酶研究的日益深入,其应用领域正日渐拓宽,与此相应,新型脂肪酶的研究开发就备受关注。通过对原有脂肪酶改性或对菌株进行优化培养可以得到新型的脂肪酶[2]。本研究对一株米曲霉产脂肪酶的发酵条件进行优化 1材料与方法 1.1 材料 1.1.1菌种 米曲霉,为本实验室保藏菌种 1.1.2培养基 斜面培养基:0.2%NaNO3,0.1%Na2HPO4,0.05%KCl,0.05% MgSO4,0.001% FeSO4,3%蔗糖,1.5%~2.0%琼脂,1%麸皮. 种子培养基:0.5%玉米粉,0.5%葡萄糖,2%黄豆饼粉,0.5%酵母膏,1%NaNO3,0.1%Na2HPO4,0.05%KCl,0.05% MgSO4,0.001% FeSO4 初始设计发酵培养基:1%玉米粉,4%黄豆饼粉,1%橄榄油,1%NaNO3,Na2HPO4 0.1%,0.05%KCl,0.05% MgSO4,0.001% FeSO4 1.2 方法 1.2.1发酵培养 将菌种由斜面接种到40mL(250mL的三角瓶)的种子培养基中,30℃,230 r/min 的培养24h 制成液体菌种,然后按10%的接种量接入到40 mL(250 mL的三角瓶)发酵培养基中,在30℃,230 r/ min下进行发酵培养 1.2.2 酶活测定方法 采用橄榄油底物乳化法[3]。加入5mL乳化橄榄油(4%PVA∶橄榄油=2∶1)及4mL0.05M的磷酸缓冲液(pH=7.5)于100mL小烧杯中,在37 ℃水浴锅中预热5min ,加入1 mL 酶液,反应10 min ,加入15 mL浓度95 %乙醇,滴加3d酚酞,用0. 05 mol/ L NaOH 溶液滴定,记录消耗的碱量V1 。空白液先加乙醇,再加酶液,其余操作相同,此时消耗的碱量为V0。在此条件下,1min生成1μmol的脂肪酸定义为1个酶活力单位 2结果与分析 2.1 碳源的选择 改变初始设计培养基中的碳源,分别以1%的玉米粉、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖、果糖、玉米淀粉、麦芽糖、甘露醇、糊精作为碳源,研究不同碳源对产酶的影响。结果表明(图1):不同碳源对产酶影响较大,以蔗糖、葡萄糖、乳糖相对较好,玉米淀粉和甘露醇为碳源时产酶量最低,而以玉米粉为碳源时产酶量最高。玉米粉为最佳碳源,这与如王小花报道的蔗糖是最佳碳源的研究结果不同[2] 图1不同碳源对产酶的影响 2.2 氮源的选择 氮源分为无机氮源(硫酸铵、硝酸铵、尿素等)、有机氮源(如大豆粉、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白等)和复合氮源。一般认为复合氮源对微生物生长及产酶效果较好[4]。有机氮源一般比无机氮源要好, 如蛋白胨和酵母膏在细菌脂肪酶的生产中应用十分广泛[5]。以1%的玉米粉为碳源,分别选用4%的黄豆饼粉、蛋白胨、酵母粉、1%的NaN03、NH4NO3作为氮源, 研究不同氮源对产酶的影响。试验表明(图2):有机氮源为蛋白胨和酵母膏时,产酶量最高而且相当,选择蛋白胨为有机氮源,无机氮源为硝酸钠时产酶水平最佳 图2氮源对产酶的影响 2.3 Plackett-Burman实验设计筛选重要因子 采用Plackett-Burman实验设计对培养基配方各组分(包括玉米粉,蛋白胨,橄榄油,NaNO3,Na2HPO4,KCl,MgSO4,FeSO4)进行重要性筛选,确定对产酶影响显著的因素。选择N=12的8因素2水平的Plackett-Burman试验设计,进行培养基优化。以发酵培养基配方的不同组分作为优化输入因子,输入因子A-K分别代表玉米粉,蛋白胨,橄榄油,NaNO3,Na2HPO4,KCl,MgSO4,FeSO4,其中输入因子C、F、I为估计误差设置的虚拟项,每项均取高(+1)低(-1)两水平,见表1,响应值Y为脂肪酶的酶活力,表中每列代表每种因素的不同水平 表1N=12的Plackett-B