微生物基础知识在药品生产中的使用与延伸.pptVIP

普通冷冻保藏技术(-20℃) 将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。 应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。 保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。 这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。 超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。 在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。 冻干保藏 冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。 大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。 冻干菌种的保藏与再生 1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。 2．复苏： (1)在超净工作台中用70％酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂轮在安瓿中锉一道沟。 (2)用无菌纱布或无菌毛巾包好安瓿，然后用手掰开安瓿。 (3)在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。 (4)在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。 细菌的保藏 菌种的衰退与复壮 菌种衰退的特点： 大量群体中的自发突变 菌种的复壮： 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮； 2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体。 衰退的防止： 1．控制传代次数 2．创造良好的培养条件 在实践中，有人发现如创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。 如改变培养基成分、改变培养温度等。 3．利用不同类型的细胞进行接种传代 。用灭过菌的棉团进行孢子接种，不同孢子的接种尝试。 4．采用有效的菌种保藏方法 ，有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种生产性状的衰退 菌种的复壮 1．纯种分离 2．通过宿主体内生长进行复壮 。对于寄生性微生物的退化菌株，可通过接种至相应的昆虫或动、植物宿主体内的措施来提高它们的致病性。 3．淘汰已衰退的个体 ，如低温抗性筛选。 药典对无菌保证的定量标准 1973年的英国药典和1980年USP增补版提到了无菌的量化标准 Fo不小于8分钟 经灭菌后，产品中污染菌存活的概率不大于百万分之一。 中国药典在2000版起，收载了此标准。 无菌保证值：污染菌存活概率的负对数，经灭菌后，产品的无菌保证值不小于6 “无菌”的标准及概念 “每批产品中，污染品概率不得超过一百万分之一”，无菌的这一量化标准应当可以用试验来证明的。 每瓶产品微生物存活的概率却可计算的。 这就需要测试产品灭菌前微生物污染数、D值，使用对数规则，并用生物指示剂试验来证实。 量化指标 + 计算 + 试验，使无菌标准成为工业界可执行的标准 产品灭菌完全的必要措施 从公式 SAL ＝ F0/D – lgN0 看灭菌完全的必要措施 足够的F0值 产品灭菌前污染菌检测 需氧菌总计数（微生物污染水平） 污染菌耐热性 产品灭菌完全的必要措施-2 通常采用的中间控制手段： 对每批的灌封开始和结束阶段，分别对灌装好的半成品取样检测。 样品须作需氧菌总计数 将检品液置于100℃下加热10分钟，检查是否有耐热芽孢存活 须对微生物学检测结果进行趋势分析。 产品灭菌完全的必要措施-3 FDA要求－ “ 对于在灭菌前产品污染菌检测中所发现的耐热孢子，必须与验证灭菌工艺所用生物指示剂的耐热性进行对比” 产品灭菌完全的必要措施-4 具体要求： 如经热处理后检出的微生物是芽孢类微生物。需将其培养并收集芽孢，测定其的耐热性，将之与验证灭菌工艺用生物指示剂的耐热性进行对比。 如果所分离的污染菌耐热性高于生物指示