第四篇dna的自身维护与调控.pdf

DNA 聚合酶 (DNA Polymerase) 酶此最早在大腸桿菌中發現，以後陸續在其他原核生物及微生物中找到。這類酶 的 共同性質是：[1]以脫氧核苷 酸三磷酸(dNTP) 爲前軀體催化合成DNA﹔[2]需要模板和引 物的存在﹔[3]不能起始合成新的DNA 鏈﹔[4]催化dNTP 加到生長中的DNA 鏈的3-OH 末端﹔[5]催化DNA 合成的方向是5→3。下面首先介紹大腸桿菌的DNA 聚合酶 ，然後 簡略說明一下其他原核生物的DNA 聚合酶 和真核生物DNA 聚合酶 。 1．大腸桿菌 DNA 聚合酶 Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNA polⅠ)這是 1956 年由 Arthur Kornberg 首先發現的 DNA 聚合酶 ，又稱 Kornber酶 。此酶 研究得清楚而且代表了 其他DNA 聚合酶 的基本特點。 (1)理化性質：純化的DNA polⅠ由一條多peptide 鏈 組成，約含 1,000 個氨基酸殘基，MW 爲109 KD。分 子含有一個二硫鍵和一個-SH 基。通過二個酶 分子上 2+ 的-SH 基與Hg 結合産生二聚體，仍有活性。每個酶 2+ 分子中含有一個Zn ，在DNA 聚合反應起著很重要 的作用。每個大腸桿菌細胞中含有約400 個分子，每 個分子每分鐘在 37℃下能催化 667 個核苷 酸摻入正 在生長的 DNA 鏈。經過枯草桿菌蛋白酶 處理後，酶 分子分裂成兩個片段，大片段分子量爲76KD，通常 稱爲Klenow 片段，小片段的分子量爲34KD。此酶 的模板專一性和受質專一性均較差，它可以用人工合成的 RNA 作爲模板，也可以用核 苷 酸爲受質。在無模板和引物時還可以從頭合成同聚物或異聚物。 DNA Pol I 在空間結構上近似球體，直徑約65Å。在酶 的縱軸上有一個約20 Å 的深 溝(cleft)，帶有正電荷，這是該酶 的活性中心位置，在此位置上至少有6 個結合位點：[1] 模板 DNA 結合位元點；[2]DNA 生長鏈或引物結合位點；[3]引物末端結合位點，用以 專一引物或DNA 生長鏈的3-OH；[4]脫氧核苷 三磷酸結合位點；[5]5→3外切酶 活性位 點，用以結合生長鏈前方的5-端脫氧核苷 酸並切除之；[6]3→5外切酶 活性位點，用以 結合和切除生長鏈上未配對的3-端核苷 酸。 (2)功能： (1) 聚合作用：在引物RNA-OH 末端，以dNTP 爲受質，按模板DNA 上的指令由 DNA pol I 逐個將核苷 酸加上去，就是DNA pol I 的聚合作用。酶 的專一性主要 表現爲新進入的脫氧核苷 酸必須與模板DNA 配對時才有催化作用。dNTP 進入 結合位點後，可能使酶 的構形發生變化，促進 3-OH 與 5-PO4 結合生成磷酸二 酯鍵。若是錯誤的核苷 酸進入結合位元點，則不能與模板配對，無法改變酶 的 7 陳世明 整理 構形而被3-5外切酶 活性位點所識別並切除之。 (2) 3→5外切酶 活性──校對作用：這種酶 活性的主要功能是從 3→5方向識別和 切除不配對的 DNA 生長鏈末端的核苷 酸。當反應體系中沒有反應受質 dNTP 時，由於沒有聚合作用而出現暫時的游離現像，從而被 3→5外切酶 活性所降 解。如果提高反應體系的溫度可以促進這種作用，這顯示溫度升高使DNA 生長 鏈 3末端與模板發生分離的機會更多，因而降解作用加強。當向反應體系加入 dNTP，而且只加放與模板互補的上述核苷 酸才會使這種外切酶 活性受到抑制， 並繼續進行DNA 的合成。由此推論，3→5外切酶 活性的主要功能是校對作用， 當加入的核苷 酸與模板不互補而游離時則被3→5外切酶 切除，以便重新在這個 位置上聚合對應的核苷 酸。在某些T4 噬菌體突變株中DNA 複製的真實性降低， 而易發生突變，從此突變株分離得到的 T4DNA 聚合酶 的 3→5外切酶 活性很 低。相反，另外一些具有抗突變能力的T4 突變株中的T4 DNA 聚合酶 的3→5 外切酶 活性比野生型高得多，因