第6章 凝胶过滤.ppt

概 述 凝胶过滤又称分子筛或称体积排阻层析。根据溶质分子量的大小而分离的一种液相层析技术。 其特点是: （1）填料是具有一定范围的筛孔尺寸的凝胶，被分离物按分子量的差异在流动相的推动下,大分子被凝胶的筛孔排阻而先流出层析柱，小分子在孔中扩散而后流出。 （2）被分离物不与填料发生任何化学结合；降低了因不可逆结合而引起的蛋白质的损失和失活。 （3）快速纯化生物大分子，并在第一洗脱峰中，杂质流于柱中。 凝胶过滤的发展 理论与技术的发展 1951.Kosikowrky 用淀粉柱子分离蛋白质中的氨基酸； 1955.Lundyuist，Storgaras 在淀粉柱上按组分的分子量大小分离，提出排阻层析的概念； 1956.Puthven在淀粉柱上估计了分子量。 载体材料的发展 1959.Rovath,Flodin合成了葡聚糖（Sephadex）凝胶； 1962.Hierten,Mosbach合成聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide biogels）; 1964.Hierten合成琼脂糖球形凝胶（Spherieal agarose） 1976.Regnier合成甘油丙基多孔玻璃（Glycerlpropyl ） 内容提要 第一节 凝胶的分类及其性质 第二节 基本原理 第三节 操作 第四节 应用 第一节 凝胶的分类及其性质 所用的填料或载体通称凝胶； 凝胶过滤层析中的填料产品较多，为了分辨纯化效果及分离样品的活性保存，对填料（载体或介质）的选择、层析条件的确定是首要考虑因素。 凝胶筛孔的尺寸大小、凝胶颗粒的大小、均匀性、机械强度及化学稳定性均是凝胶层析的基本性质。 凝胶层析中常用凝胶包括5个主要类型，即： 葡聚糖凝胶(dextran gel商品名Sephadex) 琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose gel) 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，商品名为Bio—Gel P) Sephacryl 由琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(商品名为Superdex） 一、葡聚糖凝胶Sephadex G-型 性质： 1.亲水性：在水中易膨胀； 2.交联度的型号丰富适应各种分子量范围的分级分离； 3.稳定性：对强酸、氧化剂敏感。 4.吸附性：凝胶含少量的羧基基团能与碱性蛋白质的电荷基团发生吸附，在纯化及标准曲线制作时有影响；可用中性盐0.05M NaCl洗脱克服。 结构：右旋糖酐G 型与交联剂3－氯－1,2－环氧丙烷以醚键交联而成。 二、琼脂糖凝胶 Sepharose Sepharose 6B,4B,2B;由D-半乳糖和3，6 脱水的L-半乳糖合成的球形结构。其网状结构由糖链间的次级氢键起稳定作用。由琼脂糖的浓度控制网孔的疏密和大小。 分离范围1×104－5×107 。 Scanning electron micrograph of an agarose gel Sepharose CL(琼脂糖凝胶) Sepharose 与2、3－二溴丙醇反应形成交联琼脂糖。（Sepharose CL）其化学、物理的稳定性提高；机械强度增强；适用pH范围更宽。 分离范围1×104－5×107 。 Bio-Gel A 三、聚丙烯酰胺凝胶 Bio－Gel P 丙烯酰胺用甲撑双丙烯酰胺交联成球形的聚丙烯酰胺的亲水性干凝胶。 特性:对酸、碱的稳定性较弱，强酸、强碱引起酰胺基脱水。 工作的pH 范围2－10，在有SDS、盐酸胍、尿素、20％乙醇溶液中可安全使用。 分离蛋白质分子量范围800-1.5×105 。 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度(按球蛋白和肽计算)。 四、聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl 烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联成。其物理、化学性质稳定，工作的pH 范围2－11；可用于蛋白质、核酸、多糖、蛋白聚糖的分离。 分离范围1000－1×107。 五、Superdex 高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合的分子筛。具有稳定的物理化学性质；广泛的pH工作范围；对SDS、尿素、盐酸胍等不敏感；并不影响分离效果。 既具有琼脂糖凝胶的特性；又具有葡聚糖凝胶的特性，是Pharmacia公司推出的新一代凝胶产品，适合于精细层析分离。 目前分辨率、选择性最高的凝胶过滤介质，流速快而反压低。 Superdex 30 10,000 Superdex 75 3000-70,000 Superdex 200 10,000-600,000 内容提要 第一节 凝胶的分类及其性质 第二节 基本原理 第三节 操作 第