王清洪低氧模拟剂氯化钴.pptVIP

低氧模拟剂氯化钴对胃癌细胞BGC823中S100A4基因表达的影响 摘要 S100A4基因是肿瘤侵袭转移相关的重要基因, 该基因高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关。 为探讨S100A4基因高表达的机制, 用低氧模拟剂氯化钴处理胃癌细胞BGC823, RT-PCR、免疫组化、免疫荧光及Western blotting方法分别检测BGC823细胞中S100A4 mRNA及蛋白表达情况。结果显示, 氯化钴处理胃癌BGC823细胞后, S100A4 mRNA及蛋白表达明显增加。 提示低氧模拟剂氯化钴可促进胃癌细胞BGC823中S100A4 基因表达。 低氧是实体肿瘤的共同特征, 它是癌细胞快速增殖与血液供应相对滞后的结果。低氧引起肿瘤细胞生物学特性发生改变, 如细胞侵袭、转移能力增加, 并可能对放化疗产生耐受。低氧对细胞的影响主要通过调节基因表达而实现, 因此研究低氧环境下转移相关基因的表达变化具有重要意义。 S100A4蛋白是钙离子结合蛋白S100家族的成员之一, 可降低肿瘤细胞间黏附能力、促进细胞外基质水解和重塑、增强肿瘤细胞运动能力、促进血管生成等, 在肿瘤侵袭转移过程中发挥关键性作用。现已证实S100A4高表达与胃癌浸润、淋巴结转移及胃癌细胞体外侵袭力密切相关, 但是目前关于S100A4表达调控的研究报道甚少。低氧是否可调节S100A4表达, 尚未见报道。 我们应用生物信息学软件在S100A4 基因的调控区预测到低氧反应元件, 推测微环境低氧可能上调S100A4 基因表达。因此本实验观察了低氧模拟剂氯化钴处理对人胃癌细胞系BGC823中S100A4表达的影响, 旨在研究微环境低氧对胃癌侵袭转移影响的机制, 并探讨S100A4基因表达调控的新途径。 材料和方法 主要材料: BGC823细胞系; RPMI 1640培养基、胎牛血清; 氯化钴; 兔抗人S100A4 多克隆抗体; b-actin抗体; 总RNA 提取试剂Trizol; 反转录试剂盒及PCR扩增试剂盒; PCR引物。 细胞培养和低氧诱导: 取低分化的人胃腺癌细胞系BGC823, 用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液, 另加青霉素 (100 U/mL)和链霉素(100 mg/mL), 37℃、5% CO2及饱和湿度的条件下培养。细胞生长至60%~70%融合度后, 实验组加入含低氧模拟剂氯化钴(终浓度为100~500 mmol/L)的培养基, 对照组为正常培养基, 继续培养24 h后收集细胞。 RT-PCR检测BGC823细胞中S100A4 mRNA表达 收集实验组和对照组细胞, 应用 Trizol提取总RNA, 采用逆转录试剂盒将mRNA逆转录合成 cDNA, 取反转录产物2 mL进行PCR反应。S100A4引物序列: 上游: 5′-GATGTGATGGTGTCCACCTT-3′; 下游: 5′-ATTTCTTCCTGGGCTGCTTA-3′。 扩增片段长度为277 bp, 复性温度为58℃; 内参照b-actin引物序列: 上游: 5′- CCAGATCAtGTTTGAGACCT-3′; 下游: 5′- TTGAAGGTA GTTTCGTGGAT- 3′。 扩增片段长度为480 bp, 复性温度为58℃。循环条件: 95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃复性30 s, 72℃延伸30 s, 30个循环, 72℃延伸10 min。PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳, LabWORKS凝胶图像分析系统分析扩增产物条带的光密度值, 并通过S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值反映S100A4 mRNA表达量的高低。 Western blotting检测BGC823细胞中S100A4蛋白表达 收集实验组和对照组细胞, 立即置于冰上,吸净培养基并以4℃预冷的PBS 漂洗细胞1~2次, 提取细胞总蛋白, 以Bradford 法作蛋白定量后, 取 50 mg 蛋白作SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(5%积层胶, 10%分离胶),电转膜后, 加入兔抗人S100A4 多克隆抗体( 1︰1000 )和羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体, b-actin作为内参照,利用ECL显色试剂盒显色, 应用图象分析仪测定条带光密度值, 以S100A4光密度值与b-actin光密度值的比值来反映S100A4蛋白表达的高低。 免疫细胞化学及免疫荧光检测S100A4蛋白在BGC823细胞中的表达 将BGC823细胞接种于玻片上, 200 mmol/L氯化钴处理24 h后, 取出玻片, 4%甲醛固定。一抗为兔抗人S100A4多克隆抗体(1︰1000