手掌参γ-硫素基因的原核表达及其表达产物的生物活性研究.pdfVIP

摘要 摘 要 植物防御素是一类氨基端含有信号肽、羧基端含有保守半胱氨酸残基的阳离 子型分泌多肽，它属于植物固有免疫系统的重要成员，不同的植物防御素发挥不 同的功能。本研究旨在利用原核表达系统获取可溶性的手掌参-硫素蛋白 （命名为 Gcthionin ），并研究其体外活性及相关结构信息。 方法：采用pET-32a(+)作为原核表达载体，构建重组质粒，并以此为模板通过 PCR 定点突变获得两个突变体（T10F、R31G ），经IPTG 诱导获得融合蛋白，并分 别通过Ni2+-NTA 亲和层析柱和SDS对融合蛋白进行纯化和鉴定；尝试甲酸 切割 Trx-Gcthionin 融合蛋白，并采用稳态荧光光谱跟踪检测酸切割过程， Tricine-SDS检测酸切割结果；采用琼脂糖扩散分析法检测融合蛋白及其突 变体对多种细菌的抗性；采用 Bernfeld 法检测融合蛋白对黄粉甲虫 α-淀粉酶 （TMA ）和猪胰α-淀粉酶（PPA ）的抑制活性。此外，采用分子对接模拟Gcthionin 与TMA 的相互作用。 结果：测序结果表明：目标基因gcthionin 成功插入表达载体pET-32a(+)，并 成功引入Asp-Pro 酸水解位点；SDS检测结果显示Trx-Gcthionin 及其突变 体在大肠杆菌 BL21(DE3) 中能可溶性表达；融合蛋白酸切割过程内源荧光的变化 表明：色氨酸的最大荧光发射峰位置无明显变化，Trp 在 400~500nm 的磷光发射 显著增强；Tricine-SDS检测结果显示：在甲酸的作用下，融合蛋白大部分 被切割，而且能够检测到预期大小的片段；融合蛋白的抗菌活性和 α-淀粉酶抑制 剂活性检测结果显示：Trx-Gcthionin 及其突变体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没 有明显的抑菌活性，而它们对 TMA 和 PPA 的活性均有不同程度的抑制；同时， 分子对接结果表明Gcthionin 的Loop3 能够插入到TMA 的催化口袋，阻止其与底 物结合。 关键词：Gcthionin，融合蛋白，内源荧光，α-淀粉酶 I 万方数据 ABSTRACT ABSTRACT Plant defensins, which have N-terminal signal peptides and conserved cysteine residues at C-terminal domain, play an important role in plant innate immune system. It is generally known that various plant defensins perform different biological functions. In this paper, recombinant plasmid bearing gcthionin, the gene encoding γ-thionin from Gymnadnia conopsea ，was constructed and overexpressed in Escherichia coli BL21(DE3) for the purpose to investigate its biological activity. Methods: The heterogene