肝糖原的提取、鉴定及定量研究.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 汪煜灵 学 号： 3130010071 专业年级： 2013级临床医学 组 别： 第2实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 肝糖原的提取、鉴定、分离 实验日期 2014-12-25 实验地点 第2实验室 合作者 陈海玲 指导老师 朱利娜 评分 教师签名 批改日期 实验目的 掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 熟练运用溶液混匀的各种方法。 正确掌握溶液转移的操作。 正确操作使用分光光度计。 实验原理 肝糖原的提取 糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH = H20 + Cu2O (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色) 肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 实验材料 仪器： 普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平 剪刀、镊子、研钵 试管架，离心管，试管 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器 100ml容量瓶 白瓷反应板 试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L） 蒽酮显色剂 实验步骤 肝糖原的提取 +5%CCl3COOH 1ml +5%CCl3COOH 1ml +5%CCl3COOH 3ml +蒸馏水2ml 研磨至乳状 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3min（4000r/min） 取上清液 +5ml 95%乙醇，混匀，静置10min +5ml 95%乙醇，混匀，静置10min 离心5min（4000r/min） 取沉淀 沸水浴2min，溶解沉淀 +50% NaOH 0.2ml+班氏试剂0.2ml(4d) +50% NaOH 0.2ml +班氏试剂0.2ml(4d) +浓HCl 0.2ml 糖原溶液1ml 白瓷板中 沸水浴加热15min，冷却 加碘试剂0.1ml 加碘试剂0.1ml 糖原溶液0.1ml 糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液 呈色对比 混匀 沸水浴2min，观察变化 注意事项： 提取肝糖原时，向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml多，加上等量乙醇，总量接近9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。 糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定 鸡肝 0.15 g +30% KOH 1.5ml +30