重组质粒的构建、转化与重组子筛选.doc

重组质粒的构建、转化与重组子筛选 【实验目的】 学习掌握限制性内切酶的分类、特性和作用原理； 学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术； 学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA分子的技术，了解并掌握几种常见的连接方法； 掌握利用 CaCl2制备感受态细胞的方法； 学习和掌握热激法转化E.coli的原理和方法； 掌握α-互补筛选法的原理； 学习用试剂盒提取质粒DNA的方法； 学习和掌握利用琼脂糖凝胶电泳筛选重组质粒； 学习掌握重组子DNA分子鉴定的基本方法。 【实验原理】 1、体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。 2、单酶切法，即只能用一种限制性核酸内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有相同限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。单酶切法简单易行，但后期筛选工作比较复杂。本实验采用单酶切法。 3、酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的酶量。一般的，酶切0.2~1.0μg的DNA分子时，反应体积约为15~20μL，DNA的量增大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位（U）酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1μg pBR322 DNA。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%，因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。 4、载体与外源DNA的链接反应。在基因工程操作中，连接反应总是紧跟酶切反应。外源DNA片段与载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要依赖于限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸核3’-OH间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4DNA连接酶，该酶需要ATP作为辅助因子。本实验的连接反应方式是互补粘性末端DNA片段之间的连接：当载体和外源DNA用同一种限制性核酸内切酶切割时，产生相同的黏性末端，连接后形成的重组DNA分子仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列。若外源DNA插入片段和适当的载体存在同源黏性末端，这将是最方便的克隆途径。但是，在同黏性末端连接方案中，存在高背景和两向插入的弊端。 5、在基因工程中，转化的实现是借助于人工制备的感受态细胞。目前，常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法和RbCl(KCl)法。RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验要求，制备的感受态细胞暂不用时，加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。 经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热激或电穿孔技术，使载体分子进入受体细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择培养基上培养，即可筛选出重组子。 影响感受态细胞制备及转化的因素：1）细胞的生长状态和密度：从甘油管中新鲜活化而不是多次转接的菌；培养至指数前期到指数期（OD600≈0.3-0.6）；应为限制-修饰系统缺陷菌株；受体细胞与所转化的载体性质应相匹配。2）质粒DNA的质量和浓度：超螺旋构象的质粒DNA，较其线性构象的转化率高10-100倍；加入DNA的体积不应超过感受态细胞的5%，1ng的cccDNA即可使50μL的感受态细胞达到饱和；对于同一类型的载体而言，分子量越大转化率越低。3）其他药品、试剂质量：如CaCl2应用高纯度药品、超纯水配制，过滤除菌、分装保存；所有试剂、容器、耗材等均需无菌处理；感受态细胞制备过程均需要无菌、冰浴操作。 6、本实验以E.coli DH5α菌株为受