DNA测序技术的发展历程及其进展资料.ppt

第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。 第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。 2.1 454测序技术 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。 454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台Genome Sequencer 20，并测序了支原体Mycoplasma genitalium的基因组。 并在2007年推出性能更优的第二代基因组测序系统一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一——沃森(Jim Watson)的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。 2.2 Solexa测序技术 核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。 原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）技术对待测的模板DNA进行测序。 Illumina公司的新一代测序仪Genome Analyzer最早由Solexa公司研发，利用合成测序(Sequencingby Synthesis)的原理，实现自动化样本制备及大规模平行测序。 Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，配对末端读长可达到2×50 bp，每次运行后可获得超过20 GB的高质量过滤数据，且运行成本较低，是性价比较高的新一代测序技术。 SOLID通过连接反应进行测序。其基本原理是以四色荧光标记的寡核苷酸进行多次连接合成，取代传统的聚合酶连接反应。具体步骤包括： 文库准备 扩增 微珠与玻片连接 连接测序 超高通量是SOLID系统最突出的特点，目前SOLID 3单次运行可产生50 GB的序列数据，相当于17倍人类基凶组覆盖度。 2.3 SOLiD测序技术 3、第三代DNA测序技术 第三代测序技术是以单分子测序为特点的测序技术。如生物科学公司(BioScience Corporation)的HeliScope单分子测序仪(HeliScope SingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的单分子实时DNA测序技术[SingleMolecule Real Time (SMRT)DNA sequencing technology]和牛津纳米孔技术公司(Oxford Nanopore TechnologiesLtd)的纳米孔单分子测序技术等。 目前,我国也启动了第三代测序技术的研究。2009年12月,中科院北京基因组研究所与浪潮成立“中科院北京基因组研究所—浪潮基因组科学联合实验室”,利用各自的优势联合研发国产第三代测序仪,第一台样机预计2013年问世,届时有望缓解测序仪核心技术受制于国外公司的现状。 第二代的高通量测序技术已经得到了很好的发展和应用, 但是由于其测序速度、成本、准确度等关键问题的解决仍存在困难,研究者们很快将目光转向了更高更新的测序解决方案。 单分子测序也就应运而生。 第三代测序技术非常惊人！ 1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的processivity（延续性，也就是DNA聚合酶一次可以合成很长的片段），一个反应就可以测非常长的序列。 二代测序现在可以测到上百个碱基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。这为基因组的重复序列的拼接提供了非常好的条件。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 4、可直接测RNA序列。 5、可直接测甲基