稳定表达鸡ST3GALⅠ基因BHK-21细胞株的建立论文.pdf

动物医学进展，2013，34(3)：10一I5 ProgressinVeterinaryMedicine 稳定表达鸡 ST3GAL工基 因BHK一21细胞株的建立 陈 欢 ，李 明义 ，高 轩 卜 (1．河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2．山东信得科技股份有限公司，山东青岛266101) 摘 要：筛选稳定表达鸡 ST3GalI基因的BHK一21细胞株，为进一步研究禽流感病毒大规模细胞培养 生产疫苗奠定基础。克隆鸡 sT3Gal工基 因并将其插入真核表达质粒 pcDNA3．1-EGFP中构建重组质粒 pcDNA3．卜EGFP—ST3GaI，鉴定正确的真核表达载体转染BHK-21细胞后 ，ST3GalI基 因在细胞 中稳定 表达，经G418抗性和 RT—PCR筛选鉴定表达阳性的单克隆细胞株 。将 H9亚型禽流感病毒和 H5N1Re一5 禽流感病毒按不同比例接种 BHK一21一sT3Gal工细胞和空白BHK一21细胞，同时设普通胰酶和 TPCK一胰酶 对照组以检测BHK一21一sT3GalI细胞对 H9亚型禽流感病毒和 H5N1Re-5禽流感病毒的增殖效果。接毒 72h后收获细胞液，常规方法测定血凝素 (HA)滴度 。通过在 BHK一21细胞 中稳定表达 ST3Ga1I基 因，提 高BHK一21细胞表面 sAa一2，3Gal受体丰度连续传 6代后仍然能检测到其表达，荧光显微镜下能看到绿色 荧光，RT—PCR可检 出1029bp的 目的条带。结果显示，BHK一21一sT3Gal工细胞在接毒量为2 时HA滴度 达到 1：256，显著高于空白BHK一21细胞组，表明其更适于流感病毒的增殖，具备生产流感病毒疫苗的潜 力。 关键词：鸡 ；ST3GALI基因；重组质粒 ；稳定表达 ；BHK-21细胞 中图分类号 ：Q813．11 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2013)03—0010—06 唾液酸 (sialicacid)广泛存在 于各种生物组织 的真核表达载体 pcDNA3．1一EGFP—ST3GaI，体外 中，是构成细胞表面糖缀合物的组成成分 ，通常处于 转染BHK-21细胞株 ，建立稳定表达 ST3Ga1基因 糖蛋白、糖脂和其他多糖的末端以糖苷的形式存在， 的BHK-21细胞系 ，通过稳定表达 ST3GALI基因， 携带负电荷 ，因而对于细胞与细胞之间的识别及细 增强 ST3GalI催化唾液酸与乳糖 以a-2，3形式连 胞和细胞外基质的相互作用有重要影响。流感病毒 接的效力 ，从而提高 BHK一21细胞表面 a一2，3连接 通过其表面的血凝素 (HA)与宿主细胞表面唾液酸 型受体丰度，为大规模细胞培养生产疫苗提供备选 寡糖受体结合侵染宿主细胞。禽流感病毒倾 向识别 细胞系。 a一2，3连接型受体 (NeuAca-2，3-Ga1)，而人流感病毒 1 材料与方法 倾 向识别 a一2，6连接型受体 (NeuACO{一2，6一Ga1)。B一 1．1 材料 半乳糖苷 a一2，N一唾液酸转移酶 (13-galactoside~一2，N— 1．1．1 细胞 、菌株和质粒 pcDNA3．1-EGFP载体 sialyltransferase，STNGa1)属于 Ⅱ类膜蛋 白，催化生 购 自长沙赢润生物技术有限公司；pESG—T—ST3Gal 成不同连接形式唾液酸的过程 ，这一过程产生唾液 酸胞苷单磷酸酯 (CMP-NeuAc)，与各种寡糖结合从 工质粒为青 岛农业大学徐 守振 老师馈赠 ；E．coli 而组成多种糖蛋 白、糖脂及多糖 ]，使唾液酸以不同 DH5a和 BHK一21细胞为本实验室保存。Re一5(H5 连接形式存在于酸化 的糖配体末端形成受体组分 ， 亚型禽流感病毒疫苗毒株)、H9亚型禽流感毒均来 在细胞与细胞的识别、细胞分化及受体一配体联接系