第4章 细胞拆合与重组-1-.pptVIP

* * 供体细胞核移植到无核的原生质体 使原生质体与核悬浮并沉淀在硝酸钙溶液中，除去上清液，再把它们悬浮起来，以适当的比例使核与原生质体在试管中混合，离心，随后加入聚乙二醇处理使它们聚合，再慢慢地加入硝酸钙溶液，促使核的摄取，再次对原生质体清洗后，就可看到核移植到了原生质中，经这样处理就可把异核的原生质体培养成新的植物体。 4.5 细胞重组及细胞质杂交 植物叶绿素移植 先将野生型的原生质体放入低渗的甘露醇中搅拌后离心，将收集的叶绿体再浮于0.21M硝酸钠溶液中，然后收集从白化矮牵牛叶片中刚刚分离出来的第一批原生质体和单个细胞移到叶绿体悬液中，混合悬液（约每ml含细胞1万个和叶绿体10万个）培养在温度为20℃ 的低速转床上，15-30分钟；混合液每隔5分钟离心和再悬浮一次，直到近乎所有单个细胞都转变为原生质体为止，洗去混合群中游离的叶绿体，在光学显微镜下检查结果。最后发现约有0.5%的原生质体中含有1-20个不等的叶绿体。 4.5 细胞重组及细胞质杂交 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 第四章 细胞拆合与重组 4.1 细胞拆合技术的发展概况 1938年Hans Speman提出细胞核移植实验 1952年Briggs 和King首创了核移植的方法 1967年Careter发现细胞松驰素B能诱发体外培养的小鼠成纤维细胞的排核作用 1972年Prescott等首先应用离心结合CB分离哺乳类细胞的胞质体获得成功 细胞核、质分离技术与细胞融合技术汇合起来，建立了细胞重组技术 把完整细胞的细胞质和细胞核用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组织起来，培育新的细胞或新的生物个体。 细胞拆合: 4.2 基本概念 除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 胞质体（cytoplast）： 植物去核原生质体又称微质体（mini-protoplast） 或亚原生质体（subprotoplast） 4.2 基本概念 微细胞（microcell）： 只有一条或几条染色体和一薄层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质膜的核质体 4.2 基本概念 细胞重组（cell reconstruction): 将细胞融合技术与细胞核质分离技术结合，即在融合介子的诱导下，使胞质体与完整细胞合并 ，或胞质体与核体重新组成，构成细胞的过程。 4.2 基本概念 细胞重组的方式 胞质体与完整细胞重组——胞质杂种（cybrid） 微细胞与完整细胞重组——微细胞异核体（heterokaryon） 胞质体与核体（karyoplast）重新组合 ——重组细胞 4.2 基本概念 4.3 细胞拆合的方法 物理拆合法 早期 使用的核、质分离方法是用紫外线或激光将核破坏，再用微玻璃针或微吸管将其他细胞核吸入 后期 将细胞融合技术与显微外科手术结合，作微吸管将细胞核连同周围少量细胞质吸出，再吸入等量的灭活的病毒悬液，一并注入已去核的细胞中，让其发生融合 显微操作法进行细胞核移植 4.3 细胞拆合的方法 化学拆合法 细胞松驰素效应： 干扰细胞质的分裂 引起细胞表面形状的改变和排出细胞核 抑制细胞的运动 阻碍细胞的吞噬或胞饮 减低细胞的粘着程度 阻止神经细胞轴突的生长 影响葡萄糖和核苷酸的摄取 影响甲状腺素的分泌和生长激素的释放以及影响细胞质的流动 4.3 细胞拆合的方法 高浓度的细胞松驰素能使离体或活体的多种细胞发生明显的表面形态的改变。其中之一是在细胞表面产生所谓的“疱疹” 4.3 细胞拆合的方法 4.4 各种重组细胞的制备 4.4.1 去核细胞（胞质体）的制备 玻璃盖片法 塑料片法 载玻片法 离心管法 培养皿法 培养瓶法 悬液法 将细胞培养在玻璃或塑料平板上，一般培养2天以上脱核。将经37℃预温的CB溶液（含CB10μg/mL和小牛血清5%）5mL加入50mL离心管内，把生长有细胞的塑胶板面朝下，水平放入CB溶液中，在圆板上压上一个圆形的栓，以防止圆板移动位置。盖好离心管后，放入经37℃预温过的转头内进行离心。多数细胞株在11000-15000r/min离心15-30min，有80%的细胞脱核 4.4 各种重组细胞的制备 离心脱核法 4.4 各种重组细胞的制备 核体与胞质分离的情况 4.4 各种重组细胞的制备 4.4.2 核体的制备 按上述去核过程，即可得到无核的胞质体和细胞核，但在被分离出的核中带有少量胞质并围有质膜，称为“核体” 去核前作预离心，可去除贴壁不牢的