涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii).docVIP

涅氏短状杆菌(Brachybacterium nesterenkovii)摘要:本文从土壤中分离纯化得到的菌株,经中国典型培养物保藏中心鉴定,属于国内尚未发现的Brachybacterium nesterenkovii种类的一种产酶新菌株。实验表明乙醇和丙酮酸钠均可以作为繁殖ALDH菌株的诱导剂,但是乙醇的效果较好。且加入XX年[1],目前国内尚无报道。Brachybacterium属,目前仅发现了10种,分别是B. alimentarium, B. conglomeratum, B. faecium, B. fresconis, B. nesterenkovii, B. paraconglomeratum, B. rhamnosum, B. sacelli, B. tyrofermentans和B. muris。其中最早发现的是B. Faecium(Collins et. al,1988)[1]。我们筛选得到的菌种B. nesterenkovii于1992年首次报道(Gvozdyak OR et. al.,1992),与B. faecium相比,B. nesterenkovii的细胞壁结构缺少肽聚糖,两者DNA-DNA杂交结果表明同源性仅为22%[2] 从土壤中筛选得到的一种国内尚未报道过的B. nesterenkovii菌种,与国外已经报道过的B. nesterenkovii菌种在培养条件和来源上都不同。根据文献资料,目前筛选B. nesterenkovii菌株都是从奶酪中分离得到[2]。而我们得到的菌株来源于微生物多样性很高的土壤,培养的工艺条件也较为简单易行。目前国外对于这种菌种的研究大多集中在基因和氨基酸序列的测定分析方面,对于它的功能尚未有过研究报道[3]。通过对该菌株生理生化特性的鉴定(中国典型培养物保藏中心,武汉大学),我们发现该菌株能产生一些具有经济价值的酶且该酶活性较高,如过氧化氢酶、酯化酶、乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶(Aldehyde Dehydrogenase,ALDH)等。因此该菌株具有较高的应用价值和市场前景,如可以利用它开发解酒的药物或保健品等 1 材料和方法 1.1 土样来源 从湖北、甘肃和江西等地采集了30多种土样 1.2 培养基 筛选菌株选用了不同的培养基:牛肉膏培养基、土豆培养基(PDA)和MRS培养基[4] 1.3 菌种分离方法 采用平板分离法进行菌种的多次分离纯化,经镜检为单克隆菌株,于4 ℃下保藏[5] 1.4 摇瓶产酶试验 将筛选到的菌种由斜面接到30 ml(250 ml三角瓶)液体培养基中,加入一定量的乙醇、丙酮酸钠和乳酸钠诱导剂[6],于30 ℃～37 ℃、150 r/min下培养4 d～6 d。定时取样离心破碎后测定其产酶活力 1.5 乙醛脱氢酶活性的测定[7,8] ALDH的定性检测可以用甲烯蓝试剂。在缺氧条件下,可用甲烯蓝作受氢体,接受氢后还原成白色甲烯蓝,即甲烯白。另外,假定乙醛的选择性为100%,则根据褪色时间来表征酶活的高低。定义一个酶活力单位:每分钟内转化1 μm的乙醛为一个U 2 结果和分析 2.1 菌株分离及其培养条件 利用平板分离法,从湖北土样中分离得到了8株Brachybacterium nesterenkovii菌株,分别标记为1#~8#。培养条件是:配制10-5、10-4和10-3土壤溶液,取200 ?l分别加到30 ml的牛肉膏、土豆(PDA)和MRS培养基中,同时加入一定量(100 ?l～800 ?l)的乙醇、丙酮酸钠和乳酸钠诱导剂,然后将此培养基于适当温度(30 ℃～37 ℃)下培养一定时间(16 h～48 h),多次分离纯化培养,经镜检为单克隆菌株后,再通过发酵得到所需要的酶,最后对该发酵液进行破碎、离心分离提纯[9]并测其活性。实验证明只有牛肉膏培养基可以产Brachybacterium nesterenkovii菌株。在上述培养条件下得到菌株产乙醛脱氢酶的活性可达到12.5 U/ml。其活性对比见表1 p=600 w, t=10 min ( p-fragmentized, t-fragmentized time ) 表1表明乙醇和丙酮酸钠,均可以作为繁殖ALDH菌株的诱导剂,但是乙醇的效果较好。且加入200 μl的乙醇于30 ml的牛肉膏培养基,ALDH的活性更高 3 讨论 从土壤中分离纯化得到的Brachybacterium nesterenkovii菌株,经中国典型培养物保藏中心鉴定,属于国内尚未发现的Brachybacterium nesterenkovii种类的一种产酶新菌株。通过实验表明乙醇和丙酮酸钠,均可以作为繁殖ALDH菌株的诱导剂,