河南大学医学院实验教案.doc

河南大学医学院实验课教案首页 实验名称 用重组质粒DNA转化大肠杆菌 授课对象 04级药学2班 教学目标 学时分配 大体内容与时间安排：(6学时) 掌握氯化钙转化法将重组质粒DNA导入大肠杆菌的原理，及在生物工程中的作用。 讲授时间30分钟 掌握转化和转染的概念并了解几种转化的方法。 讲授时间10分钟 学会感受态细胞的制备及其转化大肠杆菌的操作过程 讲授时间20分钟 学生操作时间240分钟 授课重点 氯化钙转化法将重组质粒DNA导入大肠杆菌的原理 感受态细胞的制备及其转化大肠杆菌的操作过程 授课方法 课前准备 讲授为主，结合提问、总结，指导纠正 教材 《生物化学 主编 人民卫生出版社转化目的是把有复制能力，但在细胞外无复制活性的目的基因-载体重组体装入细胞（），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。CaCl2处理大肠杆菌细胞,提高其细胞膜的透性细胞已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）细胞细胞μl 预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。　　4、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15%左右高压灭菌过的甘油，贮存于-70℃可保存半年。 三、 E. coli DH5α感受态细胞转化　　1、分别取3个100μl感受态细胞悬液, 第一组为转化实验组：10 μl重组质粒DNA + 100μl感受态细胞； 第二组为阴性对照组： 完全不加质粒DNA的100μl感受态细胞悬液；第三组为质粒DNA对照组，即1ng 未酶切的质粒DNA + 100μl感受态细胞悬液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟。 　　2、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。　　3、向上述eppendorf管中加入0.8ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养45-60min,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。　　4、将上述菌液摇匀后取50-70μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养12-16小时。 注意事项 实验中一定要包括下面的两个对照： 加入已知量的标准超螺旋质粒DNA制品的感受态细胞。 完全不加质粒DNA的感受态细胞。 实验过程应注意无菌操作。 在制作感受态细菌时，应注意掌握大肠杆菌的培养时间。 为得到最佳结果，加入质粒DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。通常50μl感受态细胞可被1ng超螺旋质粒DNA所饱和。 热击前，质粒DNA与感受态细菌混合后，在冰上放置的时间不能少于半小时。 6. 涂布平板时，涂布棒需灭菌冷却后应用，并应注意避免用力来回涂布，因为过多的机械挤压涂布会使感受态细菌破裂，影响转化成功率。 思考题 如何提高转化效率？ 实验后记 转化后指导学生观察菌落，说明阳性、阴性对照及样品中出现现 象的原因。学生还需要加强无菌操作的观念。