EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒.docVIP

　　EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒 【摘要】 目的 构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A(LMP2A)的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro2A，脂质体法将pMSCVpuro2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RTPCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果 限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3.2×107 CFU/L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论 携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67LMP2A。 【关键词】 疱疹病毒4型 人 逆转录病毒 潜伏膜蛋白2A PT67细胞系 ［ABSTRACT］ObjectiveTo establish a retroviral vector encoding EpsteinBarr virus (EBV) latent membrane protein 2A(LMP2A) and a stable virus producing cell line.MethodsThe target gene LMP2A amplified by RTPCR id pMSCVpuro2A ine 2000. The transfectants ycin and viral titer tested. The expression of LMP2A in PT67 cell line erase chain reaction (PCR), restrictive analysis, and DNA sequencing. A stable virus producing cell line ent plified from PT67LMP2A cells，this result indicated that LMP2A could effectively express in packaging cell PT67. ConclusionThe rebinant retroviral vector pMSCVpuro2A an; retrovirus; latent membrane protein 2A; PT67 cell line EB病毒(EBV)属人类γ亚科疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症(IM)的病原体，与鼻咽癌(NPC)、Burkitts淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关。潜伏膜蛋白基因2A (LMP2A)是EBV潜伏期膜蛋白的一种,在体内外EBV潜伏感染的所有B细胞中均能检测出LMP2A，并且是NPC、BL等肿瘤细胞能稳定表达的少数EBV保守抗原之一，提示LMP2A参与EBV在淋巴细胞中的长期潜伏，并且可能在恶性肿瘤的发生发展中起一定作用。由于LMP2A分子具有潜在的T细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用，因此越来越多的研究表明，LMP2A是治疗EBV相关肿瘤理想的靶抗原。但LMP2A的生物学功能尚不清楚，为深入研究LMP2A的生物学活性，本研究通过逆转录病毒载体介导LMP2A基因的转移，旨在建立能稳定产生携带LMP2A基因的逆转录病毒的产毒细胞系PT67LMP2A。 1 材料和方法 1.1 主要材料和试剂 BglⅡ、EcoRⅠ及T4 DNA 连接酶购自TaKaRa公司；脂质体转染试剂lipofectamine 2000和嘌呤霉素(puromycin)购自美国Invitrogene公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；胎牛血清 购自杭州四季青公司；携带嘌呤霉素抗性基因(puro)的pMSCVpuro质粒系中国海洋大学于文功教授惠赠；工程菌Ecoli.JM109为本实验室保存菌种。 1.2 细胞 逆转录病毒包装细胞PT67购自中国武汉典型培养物保藏中心，用含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L的青霉素、100 g/L链霉素的DMEM，于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养。 1.3 逆转录病毒的制备 1.3.1 引物设计和目的基因的制备 根据GenBank提供的LMP2A基因编码序列，DNAstar软件设计扩增EBV LMP2A读码框架的特异性引物，并在上游引物和下游引物的5′端分别引入BglⅡ和EcoRⅠ