木霉甘露聚糖酶Man1的基因克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

Trichoderrna reesei中Manl基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 摘 要 ／ f f B一甘露聚糖酶是降解B—I，4一甘露聚糖的一类水解酶。一般所说的甘露聚糖酶 指时是B—l，4一甘露聚糖水解酶和8—1，4一甘露糖昔酶的总称。甘露聚糖酶降解甘 露聚糖成甘露寡糖，最终降解为甘露糖。因为寡糖片段的特殊生理活性，在养殖、医药、 人体保健等等方面发挥了越来越重要的作用，正成为各国争相研究的热点。 B一1，4一甘露聚糖水解酶从糖链的内部随机切断8一l，4一糖苷键，将甘露聚糖 和杂聚甘露聚糖降解为大小不一的寡糖片段。因此利用甘露聚糖酶的特性降解甘露聚糖 是有效的制取寡糖的方法。传统的甘露聚糖酶都是经过微生物如芽孢杆菌、黑曲霉、链 霉菌等直接发酵得到，产品组分复杂，提纯困难，很难达到人用的纯度标必因而在使 用上有很大的限制。分子克隆技术使得单一组分的方便获得成为可能。y， 本论文阐述了木霉甘露聚糖酶Manl的克隆及其在毕赤酵母表达体系中的表达。首 a。通过菌落PCR验证正向插入子，然后富集培养， 表达载体。然后转化大肠杆菌DH5 Red 平板筛选到12株有正常酶活性的表达，在特异底物的平板上有清晰的水解圈，对照 PCR扩增得到阳性结果，用出发菌株Trichoderma cDNA克隆连接到载体中表达，其活性和全长基因克隆的一致，说明酵母细胞能够正常 剪切该基因内部的两个内含子，表达有正常活性的酶分子。 基因工程菌避免了丝状真菌的各种毒素的潜在威胁，在使用上安全可靠。重组菌株 能够进行高密度发酵，并且可以用甲醇作为单一的碳源进行生长。因此是一种比较适合 生产的具有广阔前途的菌株。 关键词：甘露聚糖酶毕赤酵母高密庹发酵电转侈菌落PER V7 √ √ V ＼／ 2002届颅b论文 ABSTRACT Beta-Mannanaseisakindof which hydrolysisenzyme hydrolysing isSOcalled marmanase Marmanase includingbeta-1，4一mannan and into mannanwhichactas Marmanis mannanase avitalbifidusfacton degraded by oligo Inthis Manl ofTrichodermareeseiisclonedand inPichia research，the gene expressed the WaSclonedandinsertinto anew full—lengthgene pUCl8 pastoris．The plasmidforming thenew WaSconducted