人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建.docVIP

　　人血管内皮抑素毕赤酵母真核表达载体的构建 【摘要】 目的 构建人血管内皮抑素（ES）毕赤酵母真核表达载体。方法 利用RTPCR技术从人体肝脏组织扩增出ES基因，插入毕赤酵母表达载体pPIC9中，酶切鉴定并进行DNA测序鉴定。结果 成功克隆ES基因并筛选出pPIC9载体中的ES阳性克隆，测序证实其序列与已报道的ES基因序列一致。结论 用分子生物学方法构建ES毕赤酵母真核表达载体的成功，使高效表达ES蛋白成为可能。 【关键词】 内皮抑素类 人类 克隆 分子 毕赤酵母 ［ABSTRACT］ObjectiveTo construct yeast eukaryotic expression vector carrying human endostatin cDNA. Methods The functional fragment of endostatin gene plified by RTPCR from human hepatic tissue, and cloned into yeast pPIC9 expression vector. The positive clone atized sequencer.ResultsThe endostatin cDNA e as reported sequence. ConclusionThe successful construction of ES gene pPIC9 expression vector ensures the high expression of ES protein. ［KEY an; clone, molecule; construction; pichia 1997年，OREILLY等［1］从小鼠血管瘤细胞培养物中分离得到内皮抑素（ES），体内和体外实验证实，它能特异性地抑制新生血管内皮细胞生长,从而抑制多种实体肿瘤的生长和转移。ES是胶原ⅩⅧ经过蛋白酶水解产生，大约由180个氨基酸残基组成。为进一步研究ES的基因序列，探讨构建其高效表达载体的方法，为将来规模生产和临床应用提供依据，本文从人肝脏组织中提取RNA，自行设计引物，克隆ES基因，并成功地构建了其毕赤酵母真核表达载体，经测序获得的ES基因序列，与文献报道一致。现报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 人肝脏组织于青岛市市立医院普外科手术切除标本；大肠杆菌E.coli DH5α，载体pKS为青岛大学医学院病原生物学教研室保存；pPIC9(8 023 bp,ColE1ori,AmpR)购自美国Invitrogen公司。各种限制性内切酶和反转录酶（Super Script Ⅱ RNase HReverse Transcriptase）、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、RNaseA、六聚寡核苷酸，购自Promega公司。测序试剂盒、RNA提取试剂盒和PCR纯化试剂盒分别购自美国Clontech公司。Trizol试剂盒购自GIBCO/BRL公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计 参照人胶原ⅩⅧ cDNA设计ES基因引物，自胶原ⅩⅧ cDNA序列第1 504 bp处开始作为引物1的5′起始端，引入Xhol Ⅰ酶切位点；引物2的3′端始于第2 055 bp处，引入EcoR Ⅰ酶切位点。为了便于真核细胞表达载体的构建和表达蛋白的纯化，在引物1中增加了真核表达信号肽序列，在引物2中增加了6个组氨酸的氨基酸序列。P1:5′CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCACTCTCATAGAGAC3′；P2:5′CGGAATTCCTATTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTAGAGGC3′。引物由上海生物工程公司合成。 1.2.2 ES基因的RTPCR扩增 将5 g新鲜肝组织匀浆，加0.5 mL PBS，制成细胞悬液。用Trizol试剂盒提取肝脏总RNA，RTPCR按RNA提取试剂盒说明书进行。取5 μg总RNA为模板，六聚寡核苷酸和Oligo(dT)15为引物，应用RTPCR技术合成cDNA第一链，反应总体积为20 μL。取2 μL cDNA为模板，于0.5 mL离心管中加入引物1和2各约20 pmol，4种dNTP 200 μmol/L，10×PCR缓 冲液5 μL，加无菌双蒸水至总反应体积50 μL，混匀。94 ℃、4 min变性，加入Taq DNA聚合酶2.5 U，在PCR仪上进行反应：94 ℃、50 s，50 ℃、90 s，72 ℃、90 s，共进行30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，将反应产物行琼脂糖凝胶电泳，鉴定PCR产物大小。然后，按上海华舜胶回收试剂盒说明将其回收，异丙醇沉淀后，溶于20 μL