串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与.docVIP

　　串联重复核定位信号的绿色荧光蛋白融合载体的构建与 【摘要】 　　目的： 构建绿色荧光蛋白-串联重复核定位信号融合蛋白的表达载体（HisEGFP3xNLS），并在原核细胞中进行表达与纯化。方法： 采用PCR方法从原先克隆在pEGFPC1载体中的3xNLS与EGFP编码序列扩增出来，使用常规酶切和连接方法将其重组至pET14b载体中，对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株，用IPTG诱导融合蛋白表达，并利用NiNTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果： 构建的HisEGFP3xNLS融合蛋白表达载体是正确的，该载体可在大肠杆菌内高效表达，用NiNTA纯化获得了相对分子质量约36 kD的融合蛋白。结论： 成功构建了HisEGFP3xNLS融合蛋白表达载体，并在原核细胞中获得了高效表达和纯化，为进一步研究NLS介导信号分子入核提供了实验材料。 【关键词】 核定位信号 载体蛋白质类 基因表达 蛋白纯化 　　［Abstract］ Objective: To construct the expression vector of HisEGFP3xNLS fusion protein and obtain its expression and purification in E. coli. Methods： 3xNLS and EGFP sequence plified by PCR from pEGFPC13xNLS vector and cloned into pET14b vector folloe digestion, PCR and sequencing, the positive clones ed into BL21 (DE3) petent cells, and the expression of HisEGFP3xNLS fusion protein atography. Results: The constructed HisEGFP3xNLS fusion protein vector highly expressed in E. coli. iniprep Kit和NiNTA亲和树脂是QIAGEN公司产品，限制性内切酶(Nde I、BamH I)、T4 DNA连接酶和Pyrobest高保真DNA聚合酶购自TaKaRa公司，100 bp和 1 kb DNA ladder分别是Toyobo公司和Stratagene公司产品，异丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropylβDthiogalactoside, IPTG）购自SigmaAldrich公司，引物由英骏公司合成。 　　1.3 HisEGFP3xNLS融合载体的构建 　　见图1。从pEGFPC13xNLS载体中扩增EGFP和3xNLS所用的上游引物序列为5’tacatatgatggtgagcaagggcgaggagct3’，其中下划线部分是EGFP基因编码序列的第1～23位碱基；下游引物序列为5’taggatccttacgggcccgcggtaccgtcgactgca3’，其中下划线部分是添加的终止密码子及pEGFPC1载体上BamH I位点前的25位碱基的反向互补序列。用Pyrobest高保真聚合酶进行PCR反应（95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，共30个循环），扩增片段大小为848 bp。将PCR产物用Nde I和BamH I酶切，随后与Nde I和BamH I双酶切并电泳切胶回收的pET14b连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5α。挑取单菌落接种于Amp+的LB培养基中，37 ℃振摇过夜。取5 ml菌液用QIAprep Spin Miniprep Kit小量提取质粒后，用Nde I和BamH I酶切鉴定。另外使用上述引物对重组体进行PCR鉴定。酶切及PCR鉴定产物用1.2 %琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。重组体最终经测序鉴定无误后，置-20 ℃保存备用。 　　1.4 HisEGFP3xNLS融合蛋白的原核表达及纯化 　　 　　将阳性重组质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)。挑取单菌落，置于2 ml LB(Amp+)培养基中，37 ℃振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3 h。利用12 % SDSPAGE来鉴定表达融合蛋白的菌落。对有HisEGFP3xNLS融合蛋白表达的菌落进行大量（100 ml）菌液扩增诱导，6 000×g、4 ℃离心10 min；将细菌沉淀重悬于4 ml结合缓冲液（300 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaH2PO4,