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基因工程的基本操作程序 陕西师大附中 第二节 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序 获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 目的基因检测与鉴定 第一步 第二步 第三步 第四步 一、目的基因的获取 （一）从基因文库中获取目的基因 1. 基因组文库 将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。 2. 部分基因文库 受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。 3. 基因文库的构建 （1）基因组文库的构建 提取某生物 全部DNA 用适当 限制酶切割 许 多 DNA片段 与载体连接 导入受体菌群 该生物基 因组文库 （每个受体菌含有一段不同的DNA片段） （2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成 mRNA 逆转录酶 杂交双链 核酸酶H 单链DNA DNA聚合酶 双链DNA 与载体连接 导入受体菌群 该生物 cDNA文库 （二）利用PCR技术扩增目的基因 1. 原理 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。 2. 过程 高温变性（90~95℃） 低温退火（55~60℃） 中温延伸（70~75℃） 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。 多次重复 3.特点：指数形式扩增 （三）通过DNA合成仪直接合成目的基因 DNA合成仪 蛋白质的氨基酸顺序 mRAN 核苷酸序列 基因DNA的核苷酸序列 目的 基因 推测 推测 合成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。 二、基因表达载体的构建 用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。 （一）构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 质粒 目的基因 限制酶 DNA连接酶 重组DNA 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 —— 核心 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 基因表达载体的构建 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 资 料: （二）构建零件及其作用 1. 目的基因 2. 启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。 3. 终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。 4. 标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。 三、将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。 基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。 1.农杆菌转化法 （一）导入植物细胞 2.其他方法（见教材P12“生物技术资料卡”） （1）基因枪法 （2）花粉管通道法 （二）导入动物细胞 显微注射技术 含目的基因的表达载体 动 物 的 受 精 卵 含目的基因的受精卵 早 期 胚 胎 雌性动物输卵管或子宫 转基因 动 物 显微 注射 分裂 分化 移 植 发 育 （三）导入微生物细胞 2. 常用受体细胞 大肠杆菌（E.coli） 1. 过程 （1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2