水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达.docVIP

　　水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂表达载体的构建与表达 【摘要】 目的： 构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂（leech derived tryptase inhibitor,LDTI）原核表达载体,并在大肠埃希菌［BL21(DE3)］中高效表达重组蛋白。方法： 以含有目的核酸序列的质粒为模板，通过PCR技术扩增出LDTI蛋白编码序列，构建含目的片段的T克隆载体以及原核表达载体pET28aLDTI重组质粒亚克隆，进行限制性内切酶双酶切鉴定和核酸序列分析，然后将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导，以TricineSDSPAGE和蛋白质印迹方法分析和鉴定重组蛋白的表达。结果： 成功构建了水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂原核表达载体pET28aLDTI，并获得相应的融合蛋白；本实验证明， LDTI在大肠埃希菌工程菌中高效表达，在温度为33℃，IPTG浓度为0.7 mmol，诱导时间为1 h，所表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的15%左右。结论： 成功构建了LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达，为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性和生物学功能奠定了良好的基础。 【关键词】 构建； 原核表达； 水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂 ［Abstract］ Objective: To construct the prokaryotic expression vector of LDTI gene and express LDTI protein in E.coli［BL21(DE3)］.Methods： A 141 bp fragment of the LDTI gene plified by PCR technique from the template of the plasmid containing LDTI gene, then it plified and digested e, the target fragment id pET28a, the rebinant plasmid 109.The fragment e and nucleotide sequencing.The rebinant expression plasmid containing LDTI gene ed into E.coli BL21(DE3) and the target protein expression ed by TricineSDSPAGE and D18T载体购自日本TaKaRa公司，含有目的LDTI编码序列的质粒由大连TaKaRa公司合成。大肠埃希菌 JM109，BL21(DE3)及表达载体pET28a为本校张忠芳老师馈赠。 1.1.3 核酸序列分析 由上海英骏公司采用ABI377全自动测序仪器和配套的试剂盒测序。1.2 方 法 1.2.1 引物设计与合成 根据LDTI氨基酸序列推导出目的核酸序列并设计引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。上游引物序列：5′GGCATATGAAAAAAGTTTGCGC3′；下游引物序列：5′TAAGCTTTTACGTCGGGCAGGA3′。其中，为了方便克隆操作，在上下游引物中加入了限制性内切酶NdeⅠ，Hind Ⅲ的酶切位点，以便LDTI核酸片段定向克隆于相应的酶切位点上，保证阅读框架的正确性和完整性。此外在限制性内切酶Hind Ⅲ，NdeⅠ酶切位点引入1至2个保护性碱基，以利于酶切反应进行。 1.2.2 LDTI片段扩增 PCR反应体系为：DNA 0.3 μl，Taq酶2 U，10×缓冲液2 μl，dNTP 1.6 μl和引物0.4 μl，加DDW至总体积20 μl。 PCR扩增条件：预变性94℃ 2 min，94℃ 1 min →62℃ 1 min →72℃ 1 min，25个循环，反应结束前72℃延伸10 min。 1.2.3 构建T载体克隆 按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物后与T载体连接，转化感受态大肠埃希菌JM109，经过蓝白斑筛选，挑选单个阳性克隆，在100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中过夜生长，提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。 1.2.4 构建原核表达载体亚克隆 将T载体克隆双酶切后目的片段及pET28a双酶切后片段经琼脂糖凝胶电泳，回收，按照凝胶纯化试剂盒操作流程纯化PCR产物，将纯化后的两核酸片段16℃连接，过夜。转化感受态细菌JM109，挑取阳性克隆，接种于含100 μg/ml卡那霉素的LB培养基中过夜生长，按照质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒，进行双酶切和测序鉴定。 1.2.5 LDTI蛋白的诱导表达 将重组质粒pET28aLDTI转化BL21(DE3)，挑取单个菌落，接种于3 ml含100 μg/mL卡那霉素的LB培养基