纤维环源干细胞的分离和表征-苏州大学.DOC

纤维环源干细胞的分离和表征 09级临床医学 赵燕南 指导教师 李斌 摘 要：椎间盘退变是引起疾病的重要因素之一通过培育仿生椎间盘以替代病变组织这一新思路逐渐趋于可行仿生椎间盘。IVD degeneration is a major cause to lower back pain, a high-incidence disease in humans. Recently, tissue engineering of IVD has evolved into a promising approach for regenerating diseased discs. One key point is to find an ideal cell source for obtaining engineered AF tissues through a tissue engineering approach.In this study, a population of cells derived from rabbit annulus fibrosus (AF) tissues was isolated. The proliferating capability of cells was evaluated by MTT, common stem cell marker expression was examined using immunofluorescence, and multi-differentiation potential including adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis was assayed using specific inducing medium and staining solution. The results showed that the AF-derived cells possess the characters of stem cells, which can be used in further study. Key Words: Tissue engineering of IVD;AF-derived cells; proliferation; multi-differentiation potential 引言 椎间盘退变是引起疾病的重要因素之一，造成的经济损失及医疗费用十分高昂。因此，对椎间盘退变的治疗具有巨大的经济和社会意义。但手术治疗会造成脊柱结构改变,甚至可引发临近节段退变，导致更严重的脊柱疾患1,2。随着组织工程技术的日益发展，通过培育仿生椎间盘以替代病变组织这一新思路逐渐趋于可行。椎间盘中央位置的髓核和周围的纤维环构成，3,4，但其细胞类型和基质组成较为复杂。在靠近髓核的内区，主要由软骨样细胞、纤维软骨细胞及其分泌的II型胶原蛋白和软骨聚集蛋白聚糖纤调蛋白核心蛋白多糖5。过度重复力学加载或年龄的增大，都会使纤维环的结构改变，产生断裂，导致髓核受力发生变化，并最终引起椎间盘的退变6,7。因此，成功的椎间盘组织工程离不开具有足够力学强度的仿生纤维环的构建8。纤维环组织工程的两大核心问题是支架与种子细胞。支架起模板作用，为种子细胞生长、分化及基质合成提供良好的微环境。种子细胞是基质表达的关键，自我更新和增殖能力是组织工程纤维环维持其生化功能和力学强度的基础。6,8 4 9,10。然而由于纤维环中细胞类型的多样性，单纯使用纤维环细胞、髓核细胞、软骨细胞作为种子细胞，并不能很好地模拟体内纤维环中细胞组成和基质分泌，具有一定的局限性。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC) 由于具有多向分化特性，且来源广泛，可从多种组织中提取，目前在纤维环组织工程中应用较多。然而，对比不同来源的间充质干细胞发现，在同等诱导条件下它们向特定细胞类型分化的能力并不一致11,12。来源于滑膜的间充质干细胞更趋向于分化为软骨细胞，来源于脂肪的间充质干细胞分化为脂肪细胞的能力更强，而来源于骨膜和肌肉的间充质干细胞则具有较强的成骨能力。这表明，来源于某组织的间充质干细胞具有自主向该组织中所特有的细胞类型的分化的倾向13 。因此，理想的纤维环组织工程种子细胞应当是具有向纤维环细胞分化潜能的干细胞。 近期一系列研究表明，在正常及轻度退变椎间盘的纤维环中都存在具有多向分化特性的细胞，能在体外培养条件下被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，具有MSC的特征14-16。尽管已确知纤维环组织中干细胞的存在，但仍未被有效地分离鉴定出来。而未纯化的组织细胞中所含大量已终端分化的细胞不对调控因子产生分化响应，因而作为种子细胞