负载肝癌抗原树突细胞瘤苗对癌细胞免疫抑制作用.docVIP

　　负载肝癌抗原树突细胞瘤苗对癌细胞免疫抑制作用 【摘要】 目的 探讨人自体肝癌细胞裂解物致敏的树突细胞(DC)瘤苗对自体肝癌细胞免疫功能的影响。方法 从肝癌患者外周血单个核细胞中诱导DC,用相关细胞因子及自体肝癌细胞刺激活化,制备DC瘤苗;应用流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖情况，观察刺激术前及术后自体的T淋巴细胞以及产生的特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对自身肿瘤细胞的抑制效果。结果 肝癌DC瘤苗刺激术后自体T淋巴细胞增殖能力及抑制肿瘤细胞作用显著强于术前，T淋巴细胞增殖指数术后(1.86±0.15)较术前(1.18±0.13)显著增高、CD8+T细胞增殖指数术后(1.55±0.35)较术前(0.95±0.12)增加显著,术后与术前比较差异均有统计学意义(均Plt;0.05)。肝癌DC瘤苗活化的术后自体CTL对自体肝癌细胞有较强杀伤作用，杀伤率由术前的(32.35±2.26)%增加到术后的(69.80±3.45)%。结论 肝癌DC瘤苗活化的术后自体CTL对自体肝癌细胞杀伤作用比术前作用显著，DC瘤苗能有效地诱导抗肿瘤免疫反应，有望在肝癌术后的治疗中发挥作用。 【关键词】 树突细胞; 瘤苗;细胞毒性T淋巴细胞 　树突细胞(DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞，在机体抗肿瘤免疫应答的诱导中发挥重要作用〔1〕。研究发现，将肿瘤患者外周血单个核细胞分离后在体外采用相关的细胞因子进行活化，然后加入自体肝癌细胞裂解物致敏，将致敏的DC与自体T淋巴细胞共培养后，诱导产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫，发挥抗肿瘤免疫效应〔2〕。DC瘤苗抗肿瘤研究正成为肿瘤生物学治疗的新热点。近期研究表明，肿瘤患者DC免疫功能低下〔3〕。如果制备DC瘤苗回输患者体内，可激发针对肝癌抗原细胞的T淋巴细胞免疫，有望在肝癌术后的治疗中发挥作用。为此，我们应用肝癌细胞裂解物致敏的DC瘤苗，观察刺激术后与术前自体T淋巴细胞增殖能力及抑制肿瘤细胞免疫作用的情况，为肝癌DC瘤苗用于肝癌患者术后的治疗提供理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 研究对象 2007年10月至2008年9月唐山市人民医院收治的肝癌患者8例，均无远处转移灶，无严重脏器功能不全，术后病理活检为肝细胞性肝癌。 　　1.2 方法 　　1.2.1 肝癌细胞及其裂解物的制备 将手术切除的肝癌组织剪碎，经胶原酶Ⅳ、DNA酶消化后制成细胞悬液，用100%和75%的淋巴细胞分离液分离，收集管底的肝癌细胞，将5×106自体肝癌细胞在70℃和37℃下，反复冻融、筛网研磨、离心和经超声破碎，取上清液经0.2 μm滤膜过滤即为肝癌细胞裂解物，冻存备用。 　　1.2.2 DC体外培养、扩增及鉴定 取肝癌患者术前与术后外周血各50 ml，肝素抗凝,常规分离外周血单个核细胞(PBMC)，放置37℃，5%CO2孵箱中培养2 h后，吸出未贴壁细胞，留下贴壁细胞，加入含rhGMCSF 1 000 U/ml和rhIL4 500 U/ml等细胞因子的培养液，隔日加细胞因子(首次浓度的1/2)和培养基，培养7 d收集的细胞即为树突状细胞。 　　1.2.3 肝癌细胞裂解物致敏DC的制备 在肝癌患者外周血DC体外培养的第6天，加入肝癌细胞裂解物(120 μg/ml)共培养，过夜收获贴壁的细胞即为致敏DC瘤苗。 　　1.2.4 T淋巴细胞制备 取肝癌患者术前与术后外周血各100 ml,分离PBMC,置37℃、5% CO2培养箱孵育3 h,去除贴壁细胞,非贴壁细胞用含5%AB型血清的RPMI1640悬浮,注入尼龙毛柱,37℃孵育1 h,冲洗出非黏附细胞即为T淋巴细胞。 　　1.2.5 肝癌DC瘤苗对自体T淋巴细胞增殖的影响 收集诱导第8天的术前负载肝癌抗原的肝癌DC瘤苗,调整细胞浓度为1×105/ml,加入丝裂霉素C 25 μg/ml,37℃孵育45 min,PBS洗3次,完全培养基悬浮,然后与术前自体T淋巴细胞(1×106细胞/孔)按1∶10的比例混合,铺96孔培养板(200 μl/孔),同时设自体T淋巴细胞(106细胞/孔)对照,置37℃、5% CO2孵箱培养48 h,加入MTT(5 mg/ml)10 μl继续培养8 h。轻轻吸弃培养上清,加入DMSO 100 μl/孔,于570 nm处测定A值。按公式计算T淋巴细胞及CD8+T细胞增殖指数;同理，再将收集培养的术后肝癌DC瘤苗与术后提取的自体T淋巴细胞按以上实验操作，计算增殖指数。增殖指数(%)=实验组A值/对照组A值(%)。 　　1.2.6 肝癌DC瘤苗刺激自体T淋巴细胞分化为CTL及CTL对自体肿瘤细胞杀伤活性检测 于6孔板中加入术前自体T淋巴细胞(1×106细胞/孔)、术后肝癌DC瘤苗(1×105细胞/孔)以及IL2 200 U/ml,置37℃、5% CO2孵箱