重组人sCR1真核表达载体的构建、 表达及其生物.docVIP

　　重组人sCR1真核表达载体的构建、 表达及其生物 【摘要】 目的: 采用酵母细胞分泌型载体pPIC9k表达人可溶性补体受体（sCR1）, 研究重组人sCR1融合蛋白的体外生物学活性。方法: 从人外周血中提取总RNA, 应用RTPCR获得人sCR1全长cDNA, 然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体pPIC9k中, 构建含人sCR1的重组质粒（pPIC9ksCR1）, 经测序鉴定正确, 电转化入毕赤酵母细胞SMD1168中, 将经G418抗性筛选出的重组sCR1酵母细胞株进行PCR鉴定, 经甲醇诱导, 表达产物经SDSPAGE分析和D1168细胞表达出重组sCR1融合蛋白。此蛋白在SDSPAGE上表现为Mr约31000的蛋白区带, 在D1168(Pep4△his4)、 酵母分泌型表达载体pPIC9K由福州总医院全军检验中心杨湘越主任技师惠赠; 表达于大肠杆菌BL21（DE3）中的重组PET28asCR1质粒, DH5α为本室保存; RNA全血抽提试剂盒购于QIAGEN公司; 逆转录酶购于Promega公司; 胶回收试剂盒购自博日科技有限公司; 3S柱离心式酵母基因组制备试剂盒购于申能博彩生物科技有限公司; Pyrobest高保真DNA聚合酶、 各种限制性内切酶、 T4连接酶、 DNA marker DL 2000、 1000 bp DNA Ladder marker、 蛋白marker、 蛋白预染marker均购自TaKaRa公司; 引物合成及核苷酸序列均由上海英俊生物技术有限公司和上海生工生物工程技术有限公司测定; 溴化乙锭（EB）、 生物素、 酵母氮碱（YNB）干粉、 D山犁醇等均购自上海生工生物技术有限公司; Ni2+NTA agarose购自QIAGEN公司; BCA法测定蛋白试剂盒购自Pierce公司; G418（氨基糖苷类抗菌素）购于太阳马生物工程有限公司; 鼠抗人CD35 mAb、 辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠IgG均购于晶美公司; 绵羊红细胞溶血素购于浙江省玉环县南方试剂厂; 其他所用试剂均为国产或进口分析纯; YPD、 BMGY、 BMMY和MD培养基均按Invitrogen公司的毕赤酵母菌实验操作手册配制; PE2400型DNA扩增仪为ABI公司产品; 电转杯、 电击仪、 Trans blot电转印仪及FluorSTM Multilmager凝胶成像系统均为BioRad公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 重组质粒pPIC9K sCR1的构建 　　（1）扩增 sCR1基因的引物: 5′TCT CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT GCC CCA GAT CAT TTT CTG3′; 下游引物: 5′TCT GCGGCCGCCTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG CTC CCA TTT GTT CAG GGC3′。以重组PET28asCR1质粒为模板, 用Pyrobest高保真DNA聚合酶扩增所需克隆的目的片段sCR1。（2）PCR扩增条件: 94℃变性5 min; 94℃ 1 min; 57℃ 1 min; 72℃ 1 min, 35个循环, 最后72℃延伸10 min。PCR产物经加EB的琼脂糖电泳后回收目的条带。（3）重组质粒pPIC9KsCR1构建: 用Not I、 SnaB I双酶切PCR回收产物和pPIC9K载体, 回收酶切过的pPIC9K载体和目的片段。sCR1基因与pPIC9K连接反应体系如下: PCR产物14 μL、 pPIC9K 2 μL、 T4连接酶2 μL、 10×T4连接酶缓冲液2 μL。将sCR1基因与pPIC9K于16℃连接过夜, 以连接产物转化感受态DH5α菌。将转化菌涂布于含400 mg/L氨苄青霉素的LB培养板上, 放37℃培养过夜。随机挑选5个转化子接种于含400 mg/L氨苄青霉素LB培养液中, 培养12～14 h, 少量抽提质粒DNA进行PCR鉴定和酶切鉴定, 从鉴定后的阳性克隆中随意选1个克隆命名为pPIC9KsCR1, 分别送上海英俊和上海生工有限公司进行正、 反向测序 分析。测序结果通过国际互联网络进行同源比对分析, 以美国国立生物信息中心（NCBI）的BLAST作为主要的检索工具比对及人工比对, 获得了预期的扩增目的片段, 测序结果与GenBank登录的sCR1基因片段完全一致。 　　1.2.2 感受态毕赤酵母SMD1168菌的制备 　　挑选SMD1168酵母菌单个菌落接种于10 mL YPD培养液中, 于30℃ 230 r/ min振荡培养24 h。取出转接种于50 mL的三角烧瓶中, 于30℃ 230 r/ min振荡培养过夜。扩增菌体量至菌液A600为2