短短芽胞杆菌相关基因的研究及其在生物防治中的应用.docVIP

短短芽胞杆菌功能基因的研究及其应用 马桂美，车建美，刘波*，史怀，陈铮 （福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003） 摘 要：短短芽胞杆菌分布广泛，菌落形态也呈现多样性。并且在不同生长阶段，菌落形态也有所不同。目前已经有株短短芽胞杆菌的全基因组被测序出来了，短短芽胞杆菌部分基因的功能也被人所了解，如编码二硫化物氧化还原酶的基因bdb、α-乙酰乳酸脱羧酶的基因aldB、耐碱性木聚糖酶xylB基因和细胞壁的合成基因等，特别是有抗菌活性的短杆菌酪肽的合成，其合成过程及所需酶均有研究。因短短芽胞杆菌的分布广泛、抗逆性、分泌胞外蛋白等优点，已被用于生物防治、作为分泌表达外源蛋白的宿主和微生物降解等方面。胞外物质被用于生物防治，但其胞外物质的成分还有待研究。 关键词：短短芽胞杆菌，基因，生物防治 Abstract: Key words: 所有外文作者统一成Almenar et al. 引言 短短芽胞杆菌分泌蛋白能力强，细胞壁结构简单不含内毒素，具有临床和环境方面的安全性[3,4]。形成抗逆性强的芽孢，提高了环境适应能力和与土著微生物的竞争力，这些优点都为短短芽胞杆菌作为生防菌提供了便利。就目前情况来看，短短芽胞杆菌不仅被用于防治病虫害，在环境治理中也扮演着重要角色，而且在工业生产中也被应用利用短短芽胞杆菌降解有毒物质。短短芽胞杆菌的诸多优点，为其在很多领域发挥重要作用提供了便利，但其基因的功能研究的还不是很透彻，。 1、短短芽胞杆菌生物学特性 1.1 短短芽胞杆菌形态学特性 短短芽胞杆菌菌体呈杆状，革兰氏阳性，产芽孢。生长阶段不同，菌体形状也发生一定的变化，延迟期菌体呈细长的杆状，对数期菌体呈短而粗的杆状，稳定期菌体又呈现细长的杆状。周生鞭毛，菌体约为0.8-2.2 μm。 1.2 短短芽胞杆菌的分子检测 由于16 rRNA在细菌系统发育中的保守性，利用特异引物扩增16S rRNA基因片段，进行鉴定。Shida等报道以Brev174F和1377R作为短短芽胞杆菌属的特异性引物。16S rRNA序列特异性引物:Brev174F：5′AGACCGGGATAACATAGGGAAACTTAT3′；1377R：5′GGCATGCTGATCCGCGATTACTAGC3′。扩增后的片段大小约为1200 bp。2、短短芽胞杆菌基因组研究 已经有株短短芽胞杆菌的基因组序列被测出来了，其中一株是福建省农业科学院，另一株为短短芽胞杆菌NBR100599（/genomeprj/29147），（请唐唯其稍微补充一下信息）。对短短芽胞杆菌全基因组的分析目前还不够深入，有待于进一步分析。 3、短短芽胞杆菌功能基因的研究 3.1 巯基-二硫化物氧化还原酶基因bdb 二硫键在一些功能蛋白中起着很重要的作用，二硫键在试管中可以自发的合成，但是其合成速率较生物体中慢[6]。因此推断，生物体中存在催化二硫键形成的基因或蛋白。在大肠杆菌中发现dsbA基因，DsbA蛋白是大肠杆菌的周质蛋白，但其含有一段Cys-Pro-His-Cys多肽序列，此序列与硫氧还蛋白和二硫化物异构酶蛋白活性位点结构相似。dsbA基因突变体会造成一些周质蛋白的缺失，如碱性磷酸酶、外膜蛋白A（OmpA）、β-内酰胺酶[3]、鞭毛基体的P-环蛋白[8]等。 TATSUYA ISHIHARA等1995）于短短芽胞杆菌中克隆出编码二硫化物氧化还原酶bdb基因， bdb基因的序列如图1，序列大小为354 bp，编码117个氨基酸残基的多肽，N端 27个氨基酸残基有典型的分泌型信号肽的特征。Cys-X-X-Cys结构是二硫化物氧化还原酶的保守结构，也是二硫氧化还原酶的活性中心[6]Bdb、 DsbA和PDI均有此结构。大肠杆菌dsbA基因缺失突变体，不能借助鞭毛自由移动，因此TATSUYA ISHIHARA等选用大肠杆菌的dsbA突变体作为克隆表达的受体。将短短芽胞杆菌的bdb基因转入大肠杆菌体内，观察大肠杆菌的行为变化和碱性磷酸酶活性。 图1bdb基因序列（来自文献9） 3.2 α-乙酰乳酸脱羧酶基因aldB α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中发挥重要作用，啤酒发酵中双乙酰是啤酒风味成熟的关键，双乙酰的含量过高时，会影响啤酒的风味。α-乙酰乳酸脱羧酶可将双乙酰的前体α-乙酰乳酸快速催化降解为乙偶姻，不经过双乙酰的生成步骤，不仅可以使啤酒很快的成熟，而且很大程度上减少了啤酒中α-乙酰乳酸的残存。酵母菌中不存在α-乙酰乳酸脱羧酶基因，只能通过添加α-乙酰乳酸脱羧酶制剂及采用基因工程酵母菌。 1990年BRGE DIDERICHSEN等发现一株短短芽胞杆菌可以产生α-乙酰乳酸脱羧酶，采用克隆技术，将α-乙酰乳酸脱羧酶的基因aldB克隆出来，采用双脱氧的方法得到α-乙酰