20150710动物传染病抗体检测技术.ppt

倒置荧光显微镜 THANKS 动物传染病抗体的检测 2015.7.11 血清学试验的类型 凝集试验 沉淀试验 补体结合试验 中和试验 免疫标记技术 凝集试验的类型 ---直接凝集试验和间接凝集试验 直接凝集试验：颗粒性抗原与抗体进行的凝集试验 平板凝集试验 全血平板凝集试验，用于鸡白痢、鸡败血支原体病的检疫 血清平板凝集试验，用于布氏杆菌病的检疫 试管凝集试验 凝集试验 颗粒性抗原（细菌等） 抗体 凝集现象 鸡白痢的平板凝集试验-----种鸡场中鸡白痢的净化 血液 抗原 阴性血清 阳性血清 抗原 抗原 1 加诊断抗原 2 加鸡的全血、阳性血清、阴性血清 3 混匀 4 静置2min,观察结果。 血清平板凝集试验 ------牛羊病的初筛试管凝集试验 ------牛羊病的确诊 间接凝集试验：可溶性抗原和抗体进行的凝集试验，需颗粒性载体的参与。 间接血凝试验：红细胞为载体 如猪瘟间接血凝抗体的检测 致敏红细胞 红细胞 抗原 红细胞 抗原 致敏红细胞 被检抗体 红细胞凝集 原理： 猪瘟病毒的抗原结合与红细胞制成正向间接血凝抗原。 被检血清中如有猪瘟抗体可与红细胞表面的病毒相结合，出现红细胞凝集。 正向间接血凝检测猪瘟抗体 1. 加稀释液： 第一排的1-9孔、第三排1-3孔、5-6孔，第四排的1-12孔每孔加入稀释液50ul； 2. 倍比稀释： 被检血清稀释：每个检样用一排进行倍比稀释，吸取50ul被检血清加入第一排的第一孔，倍比稀释到第9孔； 阴性血清稀释：吸取阴性对照血清50ul第三排孔的第一孔，倍比稀释到第3孔；第5、6孔为稀释液对照，不加血清； 阳性血清稀释：吸取阳性对照血清50ul加入第四排的第一孔，倍比稀释到第12孔； 2. 加猪瘟正向间接血凝抗原，每孔各50ul；以上各孔加入抗原25ul；振荡混匀1min; 3. 反应：37C孵育2h; 4. 观察结果： 阴性对照的第3孔和稀释液对照孔应为孔底圆点，液体澄清；阳性对照的1-8孔为完全凝集，结果正常可读。 被检样品完全凝集的孔数为抗体效价。 接种猪瘟疫苗的猪群免疫抗体效价至少应达到1:16，具有保护力。 正向间接血凝检测猪瘟抗体 沉淀试验的类型 环状沉淀试验 琼脂凝胶扩散试验 免疫电泳 环状沉淀试验 方法：在小口径试管中进行。 原理：试管内，下层沉淀素与上层沉淀原在液体界面应形成白色沉淀环。 白色沉淀环 沉淀原 沉淀素血清 用途：主要用于抗原的定性试验，如炭疽杆菌的Ascoli试验、链球菌的血清型鉴定、血迹鉴定等。 1%琼脂凝胶孔径为85nm，能使许多可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散。当抗原与抗体在凝胶中的一定位置上相遇时，则两者结合形成沉淀线。 抗体的检测：测抗体时，加待检血清的相邻孔应加入标准阳性血清作为对照，以资比较。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血清最大稀释度为抗体效价。 传染性法氏囊抗原、抗体特异性结合出现的沉淀线 白色沉淀线 由于病毒个体微小，须用电子显微镜观察 在病毒病的检验技术中： 电子显微镜价格昂贵、技术要求高，临床化验不用 血清学试验可检测抗体，也可检测动物体内的病毒抗原，检测时间较短比较常用 病毒的培养须用活细胞 血清学试验是猪病毒病化验常用方法 比较常用，但费力费时 胶体金标记抗体快速诊断技术（金标抗体技术） 酶标抗体技术，如酶联免疫吸附试验（ELISA） 荧光抗体技术 常用的免疫标记技术 金标检测 ELISA 酶标记抗体或抗原，定性或定量检测抗原或抗体的技术 ELISA（enzyme-linked immuno sorbent assay）酶联免疫吸附试验 移液器 酶标板 ELISA结果 原理： ELISA检测PRRS抗体（IDEXX试剂盒—阻断ELISA） PRRSV待检抗体 酶标PRRSV抗体 PRRSV抗原 原理： ELISA检测PRRS抗体（IDEXX试剂盒—阻断ELISA） PRRSV待检抗体 酶标PRRSV抗体 抗原预先吸附于反应板孔的内表面 加底物显色 1. 稀释被检血清：将被检血清稀释40倍（195ul稀释液+5ul被检血清）; 2. 加样：在酶标板的1、2孔加入阴性血清，3、4孔加入阳性血清，5-8孔依次加入上述稀释好的被检血清; 25C孵育30min; （均为100ul） 3. 洗涤：3-5次,每次每孔加入洗涤液300ul； 4. 加酶标抗体：每孔100ul；25C孵育30min; ； 5.重复第3步洗涤； 6. 加底物溶液：每孔各100ul；25C孵育30min; 7. 加终止液：每孔各100ul； 8. 读板：将检测板置于酶标仪进行检测。