不动杆菌3￣苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达 - 生物技术进展.pdf

生物技术进展 ２０１５年　 第５卷　 第４期　 ３０５~３０９ 研究论文 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１ Ａｒｔｉｃｌｅｓ 不动杆菌３￣苯氧基苯甲酸降解基因的克隆与表达 梁俊仕ꎬ　 许　 雷∗ 中国农业科学院研究生院ꎬ北京 １０００８１ 摘　 要: ３￣苯氧基苯甲酸(３￣ＰＢＡ)作为拟除虫菊酯类农药的非特异性降解中间产物ꎬ具有抗雌激素特性ꎬ可扰乱生物体 内分泌系统ꎬ比菊酯类农药迁移更广ꎬ半衰期更长ꎬ生物毒性更大ꎬ是拟除虫菊酯类农药在生物体中暴露的标志ꎮ 通过构 建４￣Ｄ菌(Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.)基因组文库ꎬ混合池驯化筛选得到４￣Ｄ 菌中降解３￣ＰＢＡ 的关键酶基因ꎬ其开放阅读框为 ９２１ｂｐꎬ编码３０６个氨基酸ꎬＧｅｎｂａｎｋ登录号为ＫＲ０２４７４２ꎮ 经同源比对和酶活验证ꎬ证实该酶为邻苯二酚双加氧酶ꎮ 根 据该ＯＲＦ序列设计引物ꎬ引物两端分别加上Ｎｄｅ Ⅰ和Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位点ꎬ以４￣Ｄ 菌基因组ＤＮＡ 为模板ꎬ成功克隆到Ｄ３４ 基因序列ꎮ 构建表达载体ｐＥＴ￣２１ｂ￣Ｄ３４ 并转化进宿主大肠杆菌ＢＬ２１(ＤＥ３)ꎬ经ＩＰＴＧ(０.１ｍｍｏｌ/ Ｌ)诱导后ꎬ表达重组菌 对３￣ＰＢＡ 降解率为１８.７％ꎮ 研究结果为３￣ＰＢＡ污染的微生物环境修复提供了理论参考ꎮ 关键词: 不动杆菌ꎻ基因组文库ꎻ３￣苯氧基苯甲酸ꎻ原核表达 ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１５.０４.０９ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ３￣Ｐｈｅｎｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ Ａｃｉｄ Ｂｉｏｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ. ＬＩＡＮＧＪｕｎ￣ｓｈｉꎬＸＵ Ｌｅｉ∗ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＢｅｉｊｉｎｇ １０００８１ꎬＣｈｉｎａ Ａｂｓｔｒａｃｔ:３￣Ｐｈｅｎｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ (３￣ＰＢＡ) ｉｓ ｋｎｏｗｎ ａｓ ｎｏｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｙｒｅｔｈｒｉｏｄｓ ｐｅｓｔｉｃｉｄｅꎬｗｈｉｃｈ ｈａｓ ａｎｔｉｅｓｔｒｏｇｅｎｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬａｎｄ ｃａｎ ｄｉｓｔｕｒｂ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｖｉｖｏ. ３￣ＰＢＡ ｈａｓ ｗｉｄｅｒ ｍｉｇｒａｔｉｏｎꎬｌｏｎｇｅｒ ｈａｌｆ￣ｌｉｆｅ ｐｅｒｉｏｄꎬａｎｄ ｈｉｇｈｅｒｂｉｏｔｏｘｉｃｉｔｙｔｈａｎｔｈｅｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄｐｅｓｔｉｃｉｄｅꎬｓｏｉｔｈａｓｂｅｅｎｕｓｅｄａｓａｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｙｒｅｔｈｒｏｉｄｓｅｘｐｏｓｕｒｅ.Ｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ４￣Ｄ(Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ.) ｇｅｎｏｍｉｃｌｉｂｒａｒｙꎬｔｈｅｋｅｙｇｅｎｅｈａｖｉｎｇａＯＲＦｏｆ９２１ｂｐａｎｄｅｎｃｏｄｉｎｇａｎａｍｉｎｏａｃｉｄｏｆ３０６ａａ ｆｏｒ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ３￣ＰＢＡ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄꎬｉｔｓ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ＫＲ０２４７４２. Ｈｏｍｏｌｏｇ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ａｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｔｈａｔ ｉｔｗａｓｃａｔｅｃｈｏｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ.Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｏｎｔｈｅａｕｔｈｏｒｉｔｙ ｏｆ ｏｐｅｎｉｎｇｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅｓ(ＯＲＦ) ａｎｄ ａｄｄｅｄｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｎｄｅ Ⅰａｎｄ ＨｉｎｄⅢ. Ｗｉｔｈ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ４￣Ｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅꎬｔｈｅ Ｄ３４ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ￣２１ｂ