皮质类固醇载体蛋白的提纯及放射免疫测定的建立-检验医学.PDF

维普资讯 上海医学检验杂~1989年第4卷第4鹃 皮质类固醇载体蛋白的提纯及放射免疫测定 的建立 上海第二医科大学 上海市 内分泌研究所 刘建美 金静莽 丁 霆 陈家伦 许 曼音 邝安堑 内窖攫要 奉文以Scpharos~一4B为基本原料．自制了皮质醇Scphatos~这一亲和层析柱。并对此柱的质 量进行了鉴定 ．用此亲和暑析柱和羟磷灰石柱从正常^血浆中提取^皮质类固醇载体蛋 自 (CBG)．对所提取的 CBG进行 了活性 纯度等方面 的鉴定． 此提纯的CBG为抗原带0备了兔抗^特异性抗血 请．建 立了CBG的 故免测定法．然后对 CBO RIA 进行方法学的考核． 皮质类 固醇 载 体 蛋 白 (Corticosteroid 通过用 TNBS法测定总氨基 量及残 余氨基量 BindingGlobulin，CBG)是 存在 于人血液 来鉴定 的。结果总氨基 量为 2．05~mol／1g 中， 由肝脏合成 的一种激素结合球蛋 白。测 凝胶，残余氨基量为 0．45~mol／1g凝胶， 定 CBG有 助于内分泌 疾病 的诊断与鉴别诊 则每克皮质醇 --Sepharose上含有皮质醇 1．6 断，以及对激素在体内的基础研究也有着重 ~mol~ 。 要意义。 2． CBG的提 纯@ ： (1)血浆 处理 ：取 ACD抗凝 冷冻血浆 一 、 皮质类固磷载体蛋 白的提纯 500ml加八cac 去纤维蛋 白，加 硫 酸 铵 材 科 2．3g离心去 除少量 杂蛋 白。加活性 炭25g 1．正常人冷冻血浆，2．皮质醇 ：上海化 去除 内源性激素，用3mol／LHCI调血清 pH 学试 剂厂。3．琥 珀酸酐 、1．6-己二胺 (AH)： 至5．5 上海试 剂一厂 。4．Sepharose一4B：Pharmacia (2)皮质~t-Sepharose柱亲 和层析 l 公司。8．二环 己基 碳二亚 胺 (DCCI)、标 准 用皮质醇Sepharose和处 理后血清搅拌 低分子量蛋 白、2．4．6．一三硝基苯磺酸钠 (T．- 上 样，用 50ra=oVL PB一0．2mol／L NaC1 NBS)、羟 磷 灰石 (HAP)：中科 院生化所东 (pHT)、50mmol／LPB(pH7)、1mmol／LPB 风试剂厂。6．H一皮质醇：上海原子核能所。 (pH7)分别洗杂蛋 白至零。用 lmmol~ PB 7．溴化氰 ；Merck公 司。8．二 甲基 甲 酰胺 含皮质醇200~g／ml洗柱至AⅢ 出现吸收峰， (DMF) 宜兴县化学试剂厂。9．正常人 自蛋 约一个柱体积，然后用 50mmol／LPB含皮质 白冻于粉 ：Calbiochem公司。 醇2O g／ml一个柱体积与凝胶搅拌，上述均 方法和结果 在 8℃ 冷室 中进行，随后 在 室 温下 用 5O I． 亲和层析柱的制备：用溴化氰活化 nnnol／LPB(pH6．5)含皮质醇 200~g／ml洗 Sepharose-4BQ。将 己二胺接在活化的 BCN 柱，收集蛋 白峰 (图 1)。透 析 、浓 缩。上 Sepharose上 形 成 AH--ScpharoseQ。用 皮 HAP柱，用 1nnnol／LPB(pH7