反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞Nogo-A调控的实验分析.pdfVIP

反义寡核苷酸对培养的视神经少突胶质细胞 Nogo—A调控的实验研究 摘 要 背景与目的：视神经损伤是常见的一类眼外伤。在颅脑损伤中，视神 经损伤发生率为O．3％～5．2％。视神经损伤后预后不良，约有40～50％的患 者失明。目前临床上尚缺乏有效的治疗手段。周围神经损伤后可再生。传 统的观点认为中枢神经受损后不能再生。视神经再生失败的原因除了与其 神经元．RGCs(retinalcells)再生能力低下、营养因子缺乏有关外， ganglion 其微环境中存在着神经生长抑制因子也是一个重要因素【”。Schwab等研究 发现少突胶 ／250对中枢神经的再生 具有强烈的 发现抑制神经再生基因 mRNAb -Nogo[13-221。 C。其中Nogo-A 编码蛋白NI．250，仅表达于少突胶质细胞。近年来的许多研究表明，利用 NI．250的单克隆抗体蹦．1可中和其抑制作用，促进中枢神经再生19’1们。但 利用反义技术来抑制或封闭抑制神经再生基因表达尚未见报道。本实验的 目的：检测神经生长抑制因子Nogo．A在培养的少突胶质细胞的表达；研 究反义寡核苷酸对Nogo．A表达的影响，筛选出安全有效的浓度为在体研 究奠定基础。r一 方法：实验分为3个部分：(一)用新生2天的Wistar大鼠视神经直接 接种，通过调整培养基获得少突胶质细胞。通过GC抗体免疫染色对培养 的细胞进行鉴定。(--)使用地高辛标记的探针，利用原位杂交方法检测少 突胶质细胞Nogo．AmRNA的表达。(--)荧光倒置显微镜下观察细胞对 6-FAM标记Nogo—A反义寡核苷酸的摄取情况：应用RT．PCR检测对照组、 pM、5u ItM) 随机序列和三种Nogo—A反义寡核苷酸浓度组(2 uM、10 mRNA的表达变化。 Nogo—A ．．、f结果：1．视神经组织接种后3天，有圆形或梭形的细胞自视神经迁出； 11悉生右，细胞基本铺满盖玻片；GC抗体免疫组化显示获得的细胞为少 mRNA阳性表达的细胞胞浆呈棕黄 突胶质细胞。2．原位杂交显示Nogo．A 色阳性反应，阴性对照实验呈阴性反应。3．荧光倒置显微镜下观察，80％ 1．t M、5uM、10 以上的细胞呈绿色荧光；RT—PCR结果显示三种浓度(2 p mRNA的表达均显著降低 M)的Nogo．A反义寡核苷酸组，Nogo—A uM mIkNA的表达无影响(PO．05)。10 (PO．01)。随机序列对Nogo．A 以下的浓度对存活无明显影响。Y 结论：本课题建立的少突胶质细胞培养方法，可获得纯化的少突胶质 mRNA；少 细胞，能满足进一步的实验需要；少突胶质细胞表达Nogo．A 突胶质细胞能直接摄取反义寡核苷酸；Nogo．A反义寡核苷酸可有效地、 u 特异性地抑制靶基因的表达。lOM以下的浓度对存活无明显影响。 少突胶质细胞 反义寡核苷酸 细胞培养 关键词：Nogo-A A onthe Of of Prelimin