酵母 RNA 提取与地衣酚显色测定法 实验十六.pdfVIP

实验十六 酵母RNA 提取与地衣酚显色测定法 实验目的 了解并掌握稀碱法提取RNA 及地衣酚显色法测定RNA 含量的基本原理和具体方法。 实验原理 由于RNA 的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异。一般有苯酚法、去污剂法和 盐酸胍法，其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA 即溶于 上层被酚饱和的水相中，DNA 和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA 即以白色 絮状沉淀析出，此法能较好地除去DNA 和蛋白质。上述方法提取的RNA 具有生物活性。 工业上常用稀碱法和浓盐酸提取RNA ，用这2 种方法所提取的的核酸均为变性的RNA ，主 要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐酸是用 10%左右氯化钠溶液，90℃提取 3—4 小时，迅速冷却，提取液经离心后，上清液用乙醇沉淀RNA 。 稀碱法使用稀碱（本实验用 0.2%NaON 溶液）使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去 蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA 或调PH2.5 利用等电点沉淀。 酵母含RNA 达2.67—10.0% ，而DNA 含量仅为0.03—0.516%，为此，提取RNA 多以 酵母为原料。 RNA 含量测定，除可用紫外吸收法及定磷法外，常用地衣酚法测定。其反应原理是： 当RNA 与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5—二羟基 甲苯（地衣酚orcinol ）反应，在Fe3+ 或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm 处有最大吸收，RNA 浓度在10—100µg/mL 范围内，光吸收与RNA 浓度成正比。地衣酚法 特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA 和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色，因此， 测定RNA 时可先测得DNA 含量再计算RNA 含量。 试剂和器材 （一）材料 干酵母粉 （二）试剂 0.2% NaON 溶液，0.05mol/L NaON 溶液，乙酸，95%乙醇，无水乙醚。 1、标准RNA 母液（须经定磷法测定取纯度） 准确称取RNA10.0mg ，用少量0.05 mol/LNaON 湿透，用玻 棒研磨至糊状的混浊液， 加入少量蒸馏水，混匀，调pH7.0 ，再用蒸馏水定容至10ml，此溶液每毫升含RNA 1mg 。 2 、标准RNA 溶液 取母液1.0ml 置10ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，此溶液为100µg RNA/ml。 3、样品溶液 控制RNA 浓度在10—100µg/ml 范围内，本实验称量自制干燥RNA 粗制品10 mg （估 计其纯度约为50% ），按标准RNA 溶液方法配制到100ml。 4 、地衣酚—铜离子试剂 将 100 mg 地衣酚溶于100 ml 浓盐酸中，再加入100 mgCuO，临用前配制，。 （三）器材 容量瓶（10ml）吸量管（2.0ml ，5.0ml ），量筒（10，50ml ），沸水浴，离心机，布氏漏 斗，抽滤瓶，石蕊试纸等。 操作方法 （一）酵母RNA 提取 称4 克干酵母粉置于100ml 烧杯中，加入40ml0.2% NaON 溶液，沸水浴加热30 分钟， 经常搅拌，然后加入数滴乙酸溶液使提取液呈酸性（石蕊试纸检查），4000r/min 离心 10—15min，取上清液，加入30ml 95%乙醇，边加边搅动。加毕，静置，待RNA 沉淀完全 后，布氏漏斗抽滤。滤渣先用95%乙醇洗两次，每次用10ml 。再用无水乙醚洗两次，每次 10ml，洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。最后，用布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥，称 量所得RNA 粗品的重量，计算： （二）RNA 地衣酚显色测定 1、标准曲线的制作 取 12 支干净烘干试管，按下表编号及加入试剂。平行做两份。加毕置沸水浴加热 25 分钟，取出冷却，以零号管作对照，于670nm 波长处测定光吸收值。取两管平均值，以RNA 浓度为横坐标，光吸收为纵坐标作图，绘制标准曲线