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发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵工程学术讨论会论文桑 脂肪酶拆分硫辛酸手性中间体 韩 丽，杨倩， 孙志浩。， 郑 璞， 倪 晔 (江南大学生物催化研究室，工业生物技术教育部重点实验室，无锡214036) 硫辛酸(Lipoic acid)是一种具有生物活性的天然产物[1]。它是多种生物系统中的一 种重要修复因子，显示出很强的生物活性。其外消旋体曾用来治疗各种肝病o]，近年研 究发现硫辛酸是一种安全有效的强抗氧化剂[3]而受到重视，有关其药理及临床应用的研 究被大量报道[1^-6]。硫辛酸的两种对映异构体显示出不同的生物活性，其中R一型对映体 异构体比S一型有效得多，因此更期望能有效合成光学纯度高的R一型硫辛酸。 艺目前已较成熟，而6一羟基一8一氯辛酸乙酯(Ethyl 酸法合成硫辛酸的中间体，通过对其拆分生成对映体纯(R)一6一羟基一8一氯辛酸乙酯来制备 (R)一硫辛酸的研究目前尚未见报道，本文的研究可以为制备(R)一硫辛酸提供一条新的途 径。 在研究过程中，我们筛选到了脂肪酶LipasePS—D，该酶能够有效的拆分6一羟基一8一氯 辛酸乙酯(见图式1)。并在此基础上系统的考查了反应温度，pH，摇床转速，底物浓度 等因素的影响，优化了反应条件。 00H + +C2}150H 6-羟基-8-氯辛酸乙酯 俾)-6-羟基-8一氯辛酸乙酯(回·6-羟基．8-氯辛酸 图1 6-羟基·8·氯辛酸乙酯的水解反应式 1材料与方法 1．1材料 1．1．1酶与试剂 基金项目：国家973项目(2003CB716008)、国家自然科学基金 长江学者和创新团队发展计划(IRT0532)资助 作者简介：韩丽，女，1982年生，硕士研究生 联系人：孙志浩，Tel,0510-—mail：SUllW@publicl．wx．js．cn 592 第四次全国发酵工程学术讨论会 mie- 脂肪酶LipaseMY购于日本MeitoSangyo公司；LipaseIM(来源于Mucor hei)；LipaseF-AP；Novozym435(来源于Candidaantarctica，物理吸附于大孔阴离子树 Pa)；脂肪酶CRL(来源于Candida 青霉脂肪酶(来源于Penicilinesp．)；碱性脂肪酶(来源于Aspergellus)；LipasePS—D(来 源于Burkholderiasp．，物理吸附于硅藻土)购自日本天野公司。 6一羟基一8一氯辛酸乙酯，由常熟万兴化工有限公司提供。其它试剂均为市售分析纯。 1．1．2实验仪器 美国VARIAN气相色谱仪，配备Star工作站，氢火焰离子检测器；恒温水浴摇床。 1．2方法 1．2．1酶催化外消旋6一羟基一8一氯辛酸乙酯水解反应 50 ml三角瓶中加入5ml不同pH值的磷酸盐缓冲液，以45mmol／L的浓度添加6 一羟基一8一氯辛酸乙酯，置于恒温水浴振荡器内振荡，加入脂肪酶启动反应。定时取样，气 相色谱测定转化率和对映体过量值。 1．2．2检测方法 CPWAX m×0．25mm×0． 产物浓度测定采用VARIAN 52CB极性色谱柱(30 DexCB(o．25mm×25 25／1m)。产物对映体过量值的测定采用手性色谱柱CP—Chirasil mmx0．25肛m)分析。 I．2．3转化率，ee值和对映体选择率E的计算方法 根据反应后6一羟基一8一氯辛酸乙酯底物的减少量与反应前底物的量的比值计算摩尔 B分别表