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生物分离工程Bioseparation Chapter 6色谱技术Chromatography 本章主要知识点 什么是色谱分离技术？ 色谱分离技术的分类 什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算？ 吸附色谱及其分类和基本原理 什么是分配色谱？ 离子交换色谱的分类及应用 凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理 高效液相色谱的分离原理及应用 蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？ 色谱技术 色谱技术是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 色谱的基本概念 固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。 按机理分，有以下几种： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 亲和层析 其他分类 色谱分离的基本概念 分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd分配系数 q、c溶质在固相和液相中的浓度 色谱参数 色谱参数 阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 洗脱体积Ve 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N理论塔板数 tR保留时间 W1/2半峰宽 Wb峰底宽度 理论塔板高度：L柱长 1、吸附色谱（Adsorption chromatography） 原理：利用溶质与吸附剂之间吸附能力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离的技术。 关键要素：吸附剂和展开剂的选择 除了传统的吸附作用色谱外，又开发出疏水作用色谱、共价作用色谱、金属螯和色谱、聚焦色谱等。 常用的吸附剂 展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 吸附色谱的操作程序 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 2、分配色谱 原理：利用混合物在两种不相混溶的液相（固定相和流动相）之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。纸层析是最广泛的一种分配层析。 当一种溶质分布在两个互不相溶的溶剂中时，它在固定相和流动相两相内的浓度之比是个常数，称为分配系数。分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多，移动快；分配系数大的溶质在固定相分配的数量多，移动慢。因此可彼此分开。 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶 固定相：通常选取各组分溶解度大的溶剂作为固定相 流动相可以是极性的（反相色谱法），也可以是非极性的（正相色谱） *反相色谱固定相是非极性的, 流动相是极性的 正相色谱 在吸附层析中，固定相为极性基团，如氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法； 适用于分离极性化合物。 3、反相色谱 在层析支持物上涂上一层高碳原子的疏水性强的烷烃类，洗脱液用极性强的溶剂，则被分离样品中的极性强的物质不被吸附，最先洗下来，得到较好的分离效果。这种层析法与普通的吸附层析法相反，故称为反相色谱。 适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。 反相色谱 固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等， 流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。 通常在流动相中加入离子对试剂（三氟乙酸）来增大蛋白质和多肽的