TRIpure总RNA抽提试剂操作方法及步骤说明书.doc

◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用，仅用于体外 总RNA提试剂目录号：RN0目录编号 包装单位 0401 25次 RN 0402 50次 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 2次 50次 ml 50 ml 氯仿 室温 异丙醇 室温 75％乙醇 室温 RNase-free H2O 室温 10 ml 10 ml 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。适用范围： 适用于各种动植物组织/细胞总RNA、DNA、蛋白的快速抽提产品储存： TR在室温下能稳定保存12个月。尽管如此，为达到最佳效果，我们建议保存在2~8°C的环境下。重要提示： 有毒物接触皮肤或者不慎吞服，会导致灼伤。一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗。若感不适，看医生并寻求苯酚和其他成分的正确治疗方案。产品介绍： TR试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1g)和细胞(107)均有较好的分离效果。TRIPURE试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIPURE抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用扩增级的DNase I来处理抽提的总RNA。 TR试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带(mRNA和hnRNA成分)，两条优势核糖体~5 kb (28S)和~2 kb(18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8。注意事项： 当TRIPURE用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。 当TRIPURE用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIPURE和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。 离心前小心平衡试管。 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧从少量的组织(1~10mg)或细胞(102~104)中分离RNA样品：往组织或细胞中加入800μl TRIPURE。待样品裂解后，加入氯仿并进行步骤2中的抽提操作。在用异丙醇沉淀RNA之前，加入5~10μg无RNA酶的glycogen作为水样层的载体。为降低其黏度在加入氯仿前用26号注射器抽吸两次以切断基因组DNA。Glycogen会留在水样层中并和RNA共析出。在浓缩到4mg/ml之前它不会抑制逆转录反应第一链的合成也不会抑制PCR。 在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60~–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（步骤4，RNA漂洗）溶于75%的乙醇在2~8°C至少可以保存一周，在–5~–20°C下至少可保存一年。 台式离心机最大能达到2,600×g的离心力，如果将离心时间延长到30~60分钟可以满足步骤2和步骤3中的操作。RNA抽提操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： 用TRIPURE抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在在15~30°C的条件下。实验所需试剂但未提供的物品： 氯仿 异丙醇 75%乙醇(用DEPC处理过的水配制) 无RNA酶的水或0.5% SDS溶液调配无RNA酶的水将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.1% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。SDS溶液必须用DEPC处理过并经高压灭菌的水配制匀浆化作用 组织 用glass或强力匀浆器搅匀组织样品，每50~100mg组织加1ml的TRIPURE。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIPURE容积的10%。 单层生长的细胞