8酶法分析.pptVIP

第8章 酶在食品分析中的应用 前言　概念、优点、局限性 　8.1　酶法测定的基本原理 8.2　酶法分析技术 8.3　酶指示剂分析食品热烫和灭菌效果 8.4　固定化酶和酶电极 酶法分析的概念、优点、局限性 酶分析的概念 酶分析就是通过对酶反应的测定来达到化学分析和临床检定目的的一类分析方法。 酶法分析的优点 酶法分析的局限性 酶法测定的基本原理 8.1　酶法测定的基本原理 测定食品成分 8.1.1　终点测定法 是酶法分析的应用最广泛的一种方法。 原理：在以待测物质为底物的酶反应中，如果使底物能够接近完全地转化为产物，而且底物或产物又具有某种特征性质，通过直接测定转化前后底物的减少量、产物的增加量或辅酶的变化等就可以定量待测物。 　　　　　　　 接近完全地转化 　　　待测物质 　　　　　　产物 （1） CA、CB和CC　3个底物浓度对吸光度变化的影响，吸光度最初变化快，以致反应在几分钟内即可完成。此方法仅需知道最初和最终吸光度；（2）根据（1）中的数据，得到底物浓度和吸光度总变化的相关图 终点法的优点 不必控制影响酶反应初速度的pH和温度等许多参数，而只需要保证酶反应进行完全。 例如，在乳酸脱氢酶催化反应中， 　　　　乳酸＋NAD＋　　　丙酮酸＋NADH 　一种方法可以加入过量的反应物NAD（P），通常是使它的浓度达到被测组分的浓度的5至10倍；另一种方法，可以加入肼除去产物丙酮酸，使反应向产物方向进行。另外，可以在完全相同的反应条件下，制作标准曲线，然后通过标准曲线得到待测化合物的浓度。 食品酶学分析中采用终点法所需要的某些酶的浓度 8.1.2　动力学测定法 根据测量转化速率，以得到底物浓度。 测定的参数可以是吸光度、荧光度、pＨ值等。初速度V0和底物的原始浓度[S 0]不是线性的，而是一条曲线。以1/ V0对1/ [S 0]作图制作标准曲线，然后从标准曲线测定待测物浓度。 该方法特点 测定速度快； 试剂用量少，成本低； 对浊度和色素的干扰不敏感； 不需要考虑反应是否进行完全； 有利于自动分析。 对裂解酶和异构酶特别适宜，当水含量保持不变时，水解酶催化的水解反应也可以认为是单底物反应。 该方法不足 对反应的条件（如酶浓度、pH和温度）要求严格，待测物的测定和标准曲线制作的条件要求完全相同。 要求分析使用的酶具有高的Km，以便测定较高的底物浓度。 准确度相对较差。 8.1.3　被测化合物是酶的辅因子或抑制剂　 如果待测物质可作为某种酶专一的辅酶或抑制剂，则这种物质的浓度和将其作为辅酶或抑制剂的酶的反应速度之间有一定关联，因此通过测定该酶的反应速度就能进行这种物质的定量。 此法可用于嘌呤、核苷酸、维生素、辅酶和食品中农药、杀虫剂的检测。同样，利用那些活性金属离子决定的酶也可进行相应无机金属离子的检定。 　　　　　 辅酶或抑制剂 　　　待测物质 　　　　　　产物 例如 利用有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶（acetychdine Esterase）的特异性抑制作用，目前已广泛应用酶化学分析方法测定痕量和微量有机磷及氨基甲酸酯类的残留。 乙酰胆碱酯酶可以催化乙酰胆碱，且同时它也可以催化水解其他一些羧酸酯，产生色差反应。当农药抑制了胆碱酯酶，则反应不能进行。 乙酰胆碱 　　　　　　　有色物质　　　　 （1）以碘代硫化乙酰胆碱作为底物 5.5’－二硫代2.2’－二硝基苯甲酸（DTNB）作为显色剂。 　　　　　　　　　 碘代硫化乙酰胆碱　　　　　　　　碘代硫化胆碱 　　　　　　　　　乙酰胆碱酯酶 　　　有机磷农药　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　 　　　　　　　　　5－巯基－硝基苯甲酸 　　　　　　于410nm波长处测定溶液的吸光度变化 通过比较特定的酶催化显色反应动力学曲线，直接显示有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱的抑制率，并以其来反映样品受农药污染的程度。 现已有依据这一原理研制出便携式残留毒性快速测定仪。敌敌畏的检出限为2.2×10－5ug/ml。此方法可以对大量农产品中农药残留超标或不超标进行快速筛选，亦可进行农药残留的定量分析。 （2）氯化乙酰胆碱 （3）植物酯酶水解2,6－二氯乙酰锭酚 植物酯酶促使底物2,6－二氯乙酰锭酚分解 此法操作简单，测定快速，很适合于水中和市售新鲜蔬菜进行农残快速检测。检测限在0.029mg/L～10 mg/L。 （4）选用乙酸萘酯作为底物 a-乙酸萘酯＋水 　　　　萘酚＋乙酸 　　　　　　　　　　　　　　　　固蓝B　　　　　 　　　　　　　　　　　　显色产物 在680nm波长处测定吸光度。检出限在mg/k