在标准曲线上查出检测管的蛋白质浓度.PPT

白蛋白的分离纯化与鉴定 　　　　　　 清洗层析柱，垂直安装好层析柱，装入蒸馏水,检查是否漏液；层析柱内是否有气泡 。如果有气泡，必须想办法排除 装柱：；悬浮葡聚糖凝胶，装入柱中，凝胶边沉降，边加入凝胶。床内不得有界面和气泡。床上表面平整。 平衡：接恒压储液瓶，用0.02M缓冲液洗脱平衡。调节流速1ml/min；设定自动部分收集器的收集时间（2ml/tube）。 层析床检查：床内不得有界面和气泡。床上表面平整。兰色的葡聚糖2000进行层析行为的检查 加样及洗脱： 收集和测定：用自动部分收集器． 清洗平衡：收取蛋白后继续用缓冲液洗脱约2个柱体积，也可用考马斯亮兰检测无蛋白质的流出液。 HD—3紫外检测仪 BSZ-100自动部份收集器 LM17型记录仪使用说明 HD—3紫外检测仪 （监测具有紫外吸收物质的检测仪器 。） 1．在仪器使用前，首先检查检测仪、记录仪的电路连接正确，然后接到220V的电源上。  2．将波长旋钮(在仪器的右侧)旋到所需波长刻度。如蛋白280nm、核酸254nm. 4．按下检测仪“电源”开关。如果灯亮，表示光源已开始工作，整台仪器进入工作状态。 BSZ-100自动部份收集器 （自动定时收集层析液，从而代替手工操作，提高工作效率 ） （2）设置定时时间 A、按下“手动/自动”键，指示灯不亮，仪器处于“手动”状态。 B、按“选择”键选定设定时间数字的位置，每按一次向后移动一个位置。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间值，设置顺序从高到低，设置好各位的值后，再按一次“选择”键，此时的数值就是定时时间。(时间单位：分钟) （3）自动收集 A、按“切换”键，“收集”指示灯亮，仪器处于“收集”工作状态。 B、按“手动／自动”键，指示灯亮，仪器处于自动收集状态，定时时间在1小时之内，以秒递减至零；定时时间在l—24小时之内，以分递减至零，仪器自动转一管，然后重新开始计时。自动收集时，如要检查设置的定时时间，只需按一下“切换“键，就能显示设置的定时时间(显示3秒钟后自动返回)。 C、停止收集，可按“手动／自动”键，使仪器处于手动状态，或关闭电源开关。 LM17型记录仪 考马斯亮蓝G-250法检测蛋白质浓度 1．按下表配置溶液 试剂： 分离胶缓冲液(1号)：1N HCl 48.0ml与Tris36.3g加蒸馏水到100ml，pH8.9。 单体交联剂(2号)：丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g加蒸馏水到100ml。 催化剂(3号)：10%过硫酸铵(AP)，临用前配制100mg/ml。 加速剂(4号)：四甲基乙二胺(TEMED)1ml加蒸馏水稀释到10ml。 凝胶缓冲液配制表 试剂 分离胶溶液（ml） 浓缩胶溶液（ml） 1号 1.60 —— 2号 2.50 1.0 10%SDS 0.10 0.1 蒸馏水 5.70 7.5 5号 —— 1.25 3号 0.05 0.1 4号 0.06 0.06 总体积 10 10 浓度（%） 7 3.0 (1)按分离胶配制表的比例(见前表)，混匀后即成为分离胶溶液。。 (2) 吸取分离胶溶液，将其沿玻璃壁缓慢注入凝胶室内，液面高度至玻璃板上端1厘米。注意排出气泡。(此溶液约在一小时内聚合为聚丙烯酰胺凝胶) （3）待浓缩胶聚合后，小心取出梳子，注意千万不要破坏样品槽。上提斜木契板让其松开。取下凝胶密封框。将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽内。插入斜契板。 （3）加样： 将电泳液加至内槽凹口以上，外槽电泳液加至平板玻璃上缘3mm处。 将样品和上样缓冲液按比例混合，小心地加入样品槽。注意每个样品槽中蛋白质的量应不少于10mg，以利于染色后观察。 实验记录 实验各操作步骤 实验中观察到的现象 实验结果：记录的图纸；凝胶分析结果 * * 生物化学教研室 蛋白质综合性实验 蛋白质盐析 葡聚糖凝胶Ｇ--25脱盐 DEAＥ－Sephadex离子交换纯化 蛋白质浓度检测 SDS— PAGE电泳法 （鉴定蛋白质纯度和分子量） 实验操作： 盐析