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PCR技术原理 厦门艾德生物医药科技有限公司 定义：PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内DNA复制的方 式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增 出来的技术。 DNA的变性 在某些理化因素作用下，DNA分子内碱基对之间的氢键断裂，使规则有序的双螺旋结构变为不规则无序的单链线团样结构的过程。 DNA的复性 在适当条件下，变性DNA的两条互补链可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，此过程称为退火(annealing)。 最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，不耐高温。 Taq DNA多聚酶的发现 1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。 DNA样品的变性 引物的退火 引物的延伸 缓冲液：起PCR反应的缓冲体系 Mg2+：Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降 低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少 dNTP：dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 引物：引物是PCR特异性反应的关键 酶：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少 模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一 引物是PCR特异性反应的关键 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 设计原则 引物长度、引物扩增跨度、引物G+C含量、TM值、引物的特异性、引物量 温度 变性温度：双链DNA在90～95℃变性 退火温度：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 延伸温度：延伸温度：一般选择在70～75℃之间 时间：时间过长会导致非特异性扩增 循环次数：循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多 PCR结果的分析 普通PCR 跑电泳分析 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 TaqMan探针 分子信标探针 谢 谢 ！ 厦门艾德生物医药科技有限公司Amoy Diagnostics Co.,LTD. 厦门艾德生物医药科技有限公司Amoy Diagnostics Co.,LTD. Amoy Diagnostics Co.,LTD. /en/ 厦门艾德生物医药科技有限公司Amoy Diagnostics Co.,LTD. Amoy Diagnostics Co.,LTD. /en/ PCR技术 DNA的特性 PCR的发展 普通PCR原理 PCR反应要素 引物 PCR反应条件 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman探针 Molecular Beacons分子信标 蝎子引物探针 双环探针 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG 激发光 发射光 SYBR-Green I 染料 英国DxS 蝎子探针技术 中美艾德特异双扩增技术 * 厦门艾德生物医药科技有限公司Amoy Diagnostics Co.,LTD. 厦门艾德生物医药科技有限公司Amoy Diagnostics Co.,LTD. Amoy Diagnostics Co.,LTD. /en/ 厦门艾德生物医药科技有限公司Amoy Diagnostics Co.,LTD. Amoy Diagnostics Co.,LTD. /en/