细胞生物学技术2011.111.ppt

2011年7月15-18日北京九华山庄全国细胞生物学学术大会 三、甲基绿—派诺宁染色法  原理： 细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程，需要有细胞内蛋白酶的激活，细胞质内常有mRNA表达的增强。 而细胞坏死则是一种被动的细胞死亡过程，细胞质内常有RNA的损失。 癌细胞 2. 悬浮型： 悬浮状生长，胞体为圆形，如某些癌细胞和血液白细胞，此型细胞观察时不如贴附型方便，但允许长时间生长，能繁殖多量的细胞。 悬浮型細胞 三、? 培养细胞形态结构 培养细胞的形态结构与体内细胞基本相同，但大体及某些细微结构方面仍存在着一定的差异。 1.? 大体形态：根据是否贴附生长，形态有所不同又分： 悬浮生长： 附着生長： 附着生长： ⑴．?? 开始为圆形形态 ，过渡演变为其原属形态。 ⑵．?? 随支持物的构型而改变： a．? 附于球体表面时，细胞与球体同心圆状。 b．支持物平坦时，细胞由圆延展成圆饼形，称为放射延展细胞。 c．过渡为极性细胞，极性细胞形态常随着细胞运动发生变化； 它们的外质的周边可分为活跃与不活跃两部分 * 活跃部分常伸出伪足，使细胞运动。 * 不活跃部分较稳定。 活跃部分 不活跃部分 极性细胞 放射延展细胞 刚贴壁细胞 四. 组织培养细胞的生长和增殖过程. 体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞的生存是在瓶皿或其他容器中，生存环境和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，需分离出部分细胞和更新营养液，这一过程称“传代”。而每次传代都影响细胞的生长进程，也就是说细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。于是就出现了与体内不同的生存特点。 培养细胞生命期： 是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。大多数二倍体细胞在培养中只能维持有限生存期，在整个生存过程中大致经历三个阶段。 ? [第I期] 原代培养( primary culture )期，也称初代培养期. 1. 从体内取组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1—4周，此期细胞呈活跃的移动，但分裂不旺盛。 2. 与体内原组织相似性大，细胞群是异质的( Heterogeneous)，即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。 3. 克隆形成率低（cloning Efficiency）:克隆形成率为单细胞状态培养时形成克隆的百分数，即细胞独立生存性差。 4. 初代培养细胞呈二倍体核型，因与体内细胞性状相似，所以是药物测试很好的对象。 [第II期] 传代期： 初代培养细胞一经传代后便称做细胞系(cell line),又称二倍体细胞系（Diploid cell line）,此期在全生命期中持续时间最长。 初代培养 传代培养 1. 此期的细胞在培养条件好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。呈二倍体核型的细胞系称二倍体细胞系。 ? 2.???? 为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存，目前世界上细胞系均在不出10代后早期冻存，如果反复传代，有可能失去二倍体性质。 [第III期] 衰退期：此期细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞形态轮廓增强，最后衰退死亡。 * 在以上三期任何一点，由于不明原因的影响（少数情况），细胞可能发生自发转化（spontaneous transformation）。 细胞发生转化的标志： 细胞获得永生性(immortality)或恶性性(malignancy)。 细胞永生性也称不死性，即细胞获得持久增殖能力。这样的细胞群体称无限细胞系，或连续细胞系（continuous cell line）。 原位末端标记技术原理 原位末端标记(in situ end—labeling，ISEL)是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶如末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TDT)、DNA聚合酶I或Klenow大片段等的催化下与凋亡细胞(因内源性核酸酶的激活而产生)的单股或双股断链相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来。 外源性核苷酸(双链DNA) 内源性核苷酸（单链、或双链DNA ) 末端脱氧核苷酸转移酶（TDT) 这类方法统称原位末端标记。 用辣根