细胞工程常规细胞培养及细胞培养特性研究 2.pptVIP

细胞工程 第一章 　绪论 4个学时第二章 　实验室配置及基本技术 2个学时第三章 植物细胞工程的理论基础 4个学时　第四章 　植物组织器官培养技术 6个学时第五章 　植物细胞培养及次生代谢产物生产 3个学时第六章 　原生质体培养和体细胞杂交 3个学时第七章 　人工种子及植物种质资源保存 2个学时 第八章　　胚胎干细胞培养 2个学时 第九章　　动物细胞培养　　　　　 4个学时第十章　　动物细胞融合与单克隆抗体 4个学时　　　第十一章　动物组织与胚胎工程 1个学时　　　　　　第十二章　试管动物与克隆动物 1个学时 一、培养细胞常规检查 （一）肉眼观察培养物颜色及混浊度 （二）倒置显微镜观察细胞生长状态 （三）培养细胞的污染检测和排除 二、细胞系的鉴定 1、微生物污染及其排除 a.空气：空气流动性大，如隔离不严，易造成不洁空气的污染。 b.器材：培养器皿、器械，CO2培养箱。 c.操作：无菌观念不强。 d.血清：质量不好、检查不严。 e.组织样本：避免用碘消毒。 由于体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力，而且培养基中加入的抗菌素的抗污染能力也有限，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救。 1）一般在细胞受到有害物污染早期或污染程度较轻时，如果能及时处理并去除污染物，部分细胞有可能恢复。 2）当污染物持续存在培养环境中，轻者细胞生长缓慢，分裂相减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，细胞质出现较多的颗粒状物质；较重者细胞增殖停止，分裂相消失，细胞质中出现了大量堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。 3）不同微生物污染物对细胞的影响也有差别，支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期、缓慢和潜在的；霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短时间内抑制细胞生长或是产生有毒物质杀灭细胞。 真菌的污染 真菌的种类很多，污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。 霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物，一般肉眼可见。短期内培养液多不混浊。 倒置显微镜下可见在细胞间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝悬浮飘荡在培养液中。高倍镜下可见到很多菌丝有链状排列的菌珠，念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。 细菌污染 细菌的污染较为多见是大肠杆菌，白色葡萄球菌，假单胞菌等。加用抗菌素的培养用液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。 一旦发生易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，出现明显混浊现象。 倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在。细胞生长停止并有中毒表现。 必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液向肉汤细菌培养基内滴加，37％下培养检测是否污染。 支原体污染 支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2um）并独立生活的微生物。约有1％可通过滤菌器。无细胞壁，形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形，在光镜下不易看清内部结构。 支原体污染以后多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间。培养液可不发生混浊，多数情况下，细胞病理变化轻微且可由于传代、换液而缓解，易被忽视；个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养皿脱落。 确定有无支原体污染可做如下检测：相差显微镜检测、荧光染色法、电镜检查、DNA分子杂交检查等。 培养细胞的污染一旦明确，多数将无法救治，如果污染的细胞不是具有重要价值，一般发现污染后应尽快弃之，以防污染扩大影响其它细胞。防止污染关键在于严格无菌操作，为防止污染和抢救有价值的细胞，目前一般可采用一下措施： （1）抗生素 （2）加温处理 （3）动物体内接种 细胞系特征及细胞系间交叉污染的测定 细胞系组织来源的鉴定 细胞的冷冻保存是细胞培养实验室的常用方法。细胞冻存与细胞传代保存相比。可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。其原理是在低于-70℃的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。 液体的固化有两种方式，一种是形成尖锐的冰晶，另一种是进入无定形的玻璃化状态。根据冻存液在冻结后是否形成冰晶，冻存细胞可分为两种方法： 非玻璃化冻存 玻璃化冻存 冰晶损伤：冻存细胞过程中，因细胞内水分结冰形成冰晶而致的细胞损伤，包括细胞膜和细胞器的损伤。 溶质损伤：冻存细胞过程中，因细胞外水分结冰形成冰晶，使得未结冰的溶液中电解质浓度升高而引起的细胞损伤。 非玻璃化低温冻存和复苏细胞的原