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利用数字PCR实现精确的MicroRNA前体定量。
利用数字PCR实现精确的MicroRNA前体定量。
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Sunali Patel 、Edward Mead 、Yongping Wang 、Patricia Hegerich 、Stephen. Jackson 、Andrzej Pietrzykowski
1. Thermo Fisher Scientific ，加利福尼亚州南旧金山，CA 94080
2. 新泽西州罗格斯大学新不伦瑞克分校动物科学系、遗传学系，NJ 08901
摘要 材料和方法
越来越多的证据表明，micro RNA 是参与几乎所有生物学过程的基本元件。成熟 图3. 细胞培养和RNA提取
microRNA可介导microRNA依赖性的基因沉默。尽管microRNA前体是microRNA生
物发生和加工的基础，但现有的大多数检测方法仍致力于成熟microRNA 的检测，
针对microRNA前体的检测却很少。microRNA前体检测面临的挑战主要归因于其较
低的丰度、必须使用参照转录本，以及序列相似性造成的干扰。
Life Technologies开发的基于硅芯片的了QuantStudio™ 3D数字PCR系统，方法可
以大大提升mir-9初级前体转录本检测的精确度。我们检测了原代神经细胞培养物 采用5天的C57BL6/J小 将黑质体切碎，进行 接种后第7天，使用培 使用mirVana™ miRNA
养基、含有20mM或
中同一microRNA 的3个不同的前体-miR-9 (pri-miR-9-1、-2和-3) ，结果显示， 鼠黑质体制备黑质体 胰蛋白酶消化，分离 50mM乙醇的培养基处 分离试剂盒从细胞中
培养物 成单细胞悬液。 提取RNA
采用QuantStudio™ 3 D数字PCR系统可以轻松克服传统microRNA前体检测方法面 理细胞
临的挑战。我们的研究证明短期和长期酒精暴露，可以触发培养细胞中miR-9前体
的变化。我们检测的可重复性极高，精度范围为1.26-2.33%。有趣的是，其中一种 图4. QuantStudio™ 3D数字PCR工作流程。
miR-9前体嵌于蛋白质编码的mRNA转录本内，而其他两种前体则是长的非编码转 密封系统
录本，这些结果说明了数字PCR (dPCR)方法的通用性。
基于芯片的Q u a n t S t u d i o ™ 3 D 数字P C R 上样迅速，几乎无样品死体积。
QuantStudio™ 3D数字PCR纳升流控系统的核心是一块很小的芯片，能够对单个样
本运行高达20,000次PCR反应。简化的工作流程仅包括三个步骤：上样、热循环和
数字结果检测。 样本+Assay 加载 读数
扩增 二次分析
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