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基因重组与基因工程 一、教学目的 在掌握基因工程的概念、重要的工具酶及其作用的基础上，进一步学习基因工程的基本操作方法及基因工程与医学的关系。 二、教学要求 1．掌握基因工程的概念、工具酶、目的基因获取方法及基因载体的特点。 2．熟悉基因工程的操作过程。 3．了解基因工程与医学的关系。 三、重点与难点： 重点：（1）重要的工具酶；（2）载体的特点及重组体的构建； （3）目的基因的获得。 难点：（1）工具酶的作用；（2）基因工程原理。 考核要求 一、核心内容：DNA重组技术（基因工程）概念，重要的工具酶及其作用，基因载体的种类和特点。 二、重点内容：目的基因获取方法，基因工程的操作过程。 内容提纲： 不同DNA分子间发生的共价连接称DNA重组(或基因重组)。 克隆就是来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。进行DNA重组所采用的方法及相关工作称为重组DNA技术，也叫基因工程。一个完整的基因克隆过程包括：目的基因的获取，克隆基因载体的选择与改造，目的基因与载体的连接(重组DNA)，重组DNA分子导入受体细胞，筛选出含目的基因的重组DNA转化细胞以及重组DNA转化细胞的扩增等。基因工程需要一些重要的工具酶，其中限制性核酸内切酶最重要。 基因工程 1973年，stanley首次在体外成功构建了重组DNA分子，导入大肠杆菌并稳定复制。 定义：将一种生物的基因与载体分子在体外进行拼接重组，转入另一种生物体细胞内，使之扩增并且表达出新的形状。 第 一 节自然界的基因重组DNA Recombination 基因重组：由于不同DNA链的断裂和连接 而产生的DNA片断的交换和重新组合，形 成新的DNA分子的过程。 第 二 节 重组DNA技术 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 限制性核酸内切酶Ⅱ作用特点 ① 均能严格地识别特定核苷酸的序列（4－8个碱基对 ）。 ② 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式（回文结构）。 ③ 能在识别的核苷酸序列当中或附近切割双链DNA。 T4DNA连接酶 催化DNA中相邻的5’磷酸基和3’羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封闭或使两个DNA分子或片段相连。 主要应用：DNA片段粘性末端连接。DNA片段平头末端连接（效率低100-200倍） 切除核酸末端的磷酸基，防止载体自身连接 （三）目的基因 Target gene:某一感兴趣的基因或DNA序列。 cDNA Genome DNA （四）基因载体 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 常用的克隆载体 质粒DNA 质粒—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 噬菌体DNA 病毒DNA 二、重组DNA技术基本原理及操作步骤 基本过程 制备目的基因和相关载体。 将目的基因和载体进行体外连接。 将重组的载体DNA导入受体细胞。 DNA重组体的筛选和鉴定。 DNA重组体的扩增表达。 （一）目的基因的获取 1. 人工合成 用DNA合成仪合成所需要的目的基因片断。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library)： 分离组织或细胞染色体DNA，用限制性核酸内切酶将其切割成许多片段后将它们与克隆载体拼接成重组DNA，将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体称基因组DNA文库。 4.PCR法 PCR是一种在体外利用DNA聚合酶催化反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的技术。 克隆载体的选择与构建 （二）目的基因与克隆载体的连接 方式： 1）同一限制酶切位点连接 2 ）不同限制酶切位点连接 （四）重组DNA 导入宿主细胞 选择适当的宿主细胞，处理使之成为感受态细胞，然后导入重组DNA。 受体细胞为原核生物： 制备感受态细胞：氯化钙转化法/电击法 受体细胞为真核生物：脂质体介导 以质粒PBR322为载体的 目的基因DNA克隆过程 以质粒pUC为载体的 目的基因DNA克隆过程 第三节 重组技术与医学的关系 思考题： 1. 何谓cDNA文库？ 2. 简述基因工程的主要步骤？ 3. 简述目的基因的制备方法。 课堂小结： 1. 基因重组与基因工程的定义及意义。 2. 基因工程的基本工程。 3. 基因工程的应用。 参考资料 1.生物化学 第七版 主编 查锡良 人民卫生出版社 2.生物化学 第二版 主编 Reginald H.Garret 3.基础医学复习纲要与强化训练 (生物化学分册) 主编 关亚