全长cDNA获取方法.pdfVIP

武汉植物学研究 2003，21(2)：l79～186 Journalof WuhanBotanicalResearch 获取全长 cDNA若干方法的比较 陶爱林，林兴华，张端品 (华 中农业大学作物遗传改 良国家重点实验室，武汉 430070) 关键词：全长 cDNA；信使 RNA；5帽子结构 ；高保真 PCR；比较 中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—47ox(2oo3)o2一Ol79—08 Comparison oftheApproachesforFull—length cDNA Enrichm ent TAo Ai—Lin，LIN Xing—Hua，ZHANG Duan—Pin (NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement．HuazhongAgriculturalUniversity，Wuhan 430070，China) Abstract：Full—lengthcomplementaryDNAs (cDNA )arecrucialforthefunctionalannotationof genes．Severalnovelexperimentalapproachesforselectiveenrichmentoffull—length cDNAsare outlinedinparallels．SomekindsofreversetranscriDtasesandhighfidelityPCR enzymesarein— troduced forpromisinghigh efficiencyofaccuratefull—length cDNA synthesis．Thetemperature profilesofthereversetranscription andPCR arealso discussed． Keywords：Full—lengtheDNA ；mRNA ；5-CAP；High—fidelityPCR ；Comparison 生物技术突飞猛进大大提高 了人类认识 自身及 eDNA存在两大技术难题 。第一 ，由于逆转录酶合成 与人类息息相关的生命现象的能力。近几年 内，人 全长 eDNA 的能力有 限，及 多数基 因距 mRNA 5端 类[1．引、模式生物拟南芥 (Arabidopsisthaliana) ] 较近的区域存在 “CpG 岛”等构成的复杂二级结构 ， 及水稻的基因组测序[6,73的草 图相继完成，给人类又 阻碍 了逆转录酶的进一步延伸 ，导致逆转录酶从延 提 出了新 的挑 战 ：如何鉴定这些序列 的功能及如何 伸复合体处解离下来而使 eDNA合成提前终止 ；第 解析生命现象的基因本质，这是一个更加庞大而又 二 ，即使逆转录酶 的全长 eDNA合成效率较高 ，但 极富挑 战性 的课题 ，正促使一 门新 的学科即功能基 是，技术上无法将这种全长 eDNA与非全长 eDNA 因组学 (Functionalgenomics)的产生与蓬勃发展 。 进行区别筛选 ，结果多数文库存在一个共 同的缺点 ： 不论功能基 因组学多么深奥 ，其认识基 因功能的基 文库 中的大多数 eDNA并非全长 eDNA，不能提供 本前提是获取可能有相关功能的基因之全长编码序 mRNA5端的序列而丢失了大量的信息。如果文库 列 。其 中，全长 eDNA序列的获取是正确地注释基 中克隆片段 的长度较小 ，则需要若干个克隆才能覆 因组序列、进行基因 的功能及 产物分析 的必要前 盖一条完整 的eDNA，这会增加后续研究工作 的难 提 [钊。 一 度 。Frohman等首先报道 了已知基因序列的全长 迄今为止，已报道 的eDNA平衡