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超分辨成像及应用课程报告 摘要 光学元件受衍射效应的限制，由阿贝定理及瑞利判据知，常规的显微技术 分辨率限制在半波长左右。为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征 ,提高光 学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求。近年来，远场荧光显微术因其非 接触、无损伤、可探测样品内部等优势成为生命科学中热点研究对象。绕过衍射 极限，提高荧光光学显微镜分辨率是个重要课题。今年的诺贝尔化学奖花落超分 辨率荧光显微技术领域。本组对获得今年诺贝尔奖的超分辨率荧光显微技术 STED （Stimulated Emission Depletion fluorescence Microscopy ）、PALM （photoactivated localization microscopy ）以及 STORM （stochastic optical reconstructionmicroscopy）进行调研，简要介绍这三种方法的原理及其中的关键 技术，包括之后的发展改进；简要介绍超分辨荧光显微术所用到的探针，及其具 体应用。 STED PALM STORM 关键词 超分辨、荧光、 、 、 、探针、应用 创新点： 在非接触之下，目前最先进的显微镜也只能看到细胞，若能将分辨 率推进到50纳米，可清晰看到细胞的活体结构、细胞内部的变化及其运动状态， 这样将更有利于对生命现象的研究与发现，对生命科学、材料科学、医学等领域， 都会有非常重要的意义。超分辨的方法能够绕过衍射极限，实现纳米级的观测。 能够做到实时地、动态地对生物组织、细胞进行三维成像。相信不久的将来，超 高分辨率显微镜将会带来整个细胞生物学的革命。 1 一、 STED 1.1受激发射损耗显微术（STED）基本原理 由于衍射效应的存在，点光源经过光学系统后不再是个理想点，平行入射的 照明光经过显微物镜聚焦之后在样品上所成的光斑并不是一个理想的点，而是一 个具有一定尺寸的衍射斑，即艾里斑。对于荧光显微镜，衍射斑范围内的样品都 会被激发光激发而发出荧光，这样该范围内的样品细节不能分辨，从而限制了荧 光显微镜的分辨率。那么，要绕过衍射极限实现超分辨，减小荧光有效发光面积 是关键，或者说减小光学系统的点扩展函数。 受激发射损耗显微术（STED）的核心思想是利用受激福射选择性消耗激发 光斑中边沿区域的激发态荧光分子从而减少有效荧光的发光范围,压缩有效PSF [1] 尺度,以此提高样品区域分辨率 。这是由 StefanW.Hell和JanWichmann在 1994 [2] [3] 年提出 ，由Hell和ThomasKlar于1999年第一次在实验室验证 。一个典型的 STED 显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光 （STED光）。激发光到达样品处的衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电 子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式 回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自 发荧光的方式回到基态 （如图1所示）。具体过程如下：正常荧光发光是荧光分 子的电子受激发光激励从基态S 态跃迁到第一激发态S 的较高振动态后，电子0 1 很快通过振动弛豫至第一激发态的最低振动态，再以自发辐射的形式回到基态发 出荧光。而在电子自发辐射前，用一束相对自发辐射荧光红移的圆环型STED光 （损耗光）将艾里斑边沿处于激发态的荧光分子处于激发态的电子以受激辐射的 方式消激发回到基态S 。我们从图1可以看到，两能级间自发辐射的能级差是0 大于受激辐射的能级差的，这就能把艾里斑中心的自发辐射荧光和边沿区域的受 激辐射发光分开。因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部 分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。这样有效荧光的发光面积得以减小，从 而提高了系统的分辨率。 受激辐射与自发荧光相互竞争有非线性效应。损耗光照射在激发光斑的边缘 位置使得该处样品中的电子发生受激发射作用的同时部分电子不可避免地仍然 会以自发荧光的方式回到基态。然而当损耗光的强度超过某一阈值之后，受激发